CDC20对体外培养的牛卵母细胞第一极体排出和卵裂影响的研究--《西北农林科技大学》2012年硕士论文
CDC20对体外培养的牛卵母细胞第一极体排出和卵裂影响的研究
【摘要】：CDC20(cell division cycle20)，也叫IPl、FZY、p55CDC，是E3泛素连接酶APC/C的一个激活剂，能够泛素化标记securin和cyclinB1。CDC20也是纺锤体检查点的靶点，在保证染色体的正确分离过程中起重要作用，因此CDC20与细胞周期紧密相关。SAC能够向APC/C~(CDC20)传送抑制信号以稳定securin和cyclinB，借此以阻止中后期转换直到所有的染色体与两极纺锤体建立正确的联系并整齐的排列到赤道板上(Bharadwaj and Yu,2004; Howell et al.,2000; Swan andSchupbach,2005)。当姐妹染色体的着丝粒与两极稳定连接后SAC失活，同时APC/C~(CDC20)介导securin和cyclinB泛素化并由26S蛋白酶体降解之(Castro et al.2005)。securin和cyclinB的降解对细胞周期和染色体分离起到决定性的作用(Thornton and Toczyski,2003)。securin的降解使肽链内切酶separase活化以打开cohesin，同时后期cyclin B的降解使周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)失活(Castro etal.,2005; Uhlmann,2003)。在中后期转换时，APC/C与其激活剂CDC20泛素化标记securin并降解之(Fang et al.,1998; Holt and Jones,2009; Yu,2002)。securin是分离酶separase的抑制剂，当securin被降解后separase能够打开cohesion的Scc1亚基使姐妹染色体分离(Bharadwaj and Yu,2004)。CDC20既是纺锤体检查点的靶点，又是APC/C的激活剂，因此CDC20的异常必然导致有丝分裂出错和周期紊乱，有可能会引起癌变的发生。
本试验以牛卵母细胞为研究对象，对CDC20在卵母细胞成熟分裂过程中的作用进行了探讨。首先，通过Realtime PCR检测了cdc20在不同时期的表达差异。其次，克隆了牛的cdc20基因并构建了其真核表达载体pcdc20-venus，并以线性化的pcdc20-venus为模板进行体外转录获得了pcdc20-venus mRNA用以超表达。同时，设计并合成了CDC20morpholino antisense oligos (CDC20MO)用以干扰CDC20基因。向卵母细胞内显微注射cdc20mRNA或CDC20MO以超表达或干扰牛卵母细胞内cdc20基因，并观察其对牛卵母细胞成熟分裂的影响。通过超表达或干扰牛卵母细胞内CDC20基因的表达，我们得到如下结论：
1.通过Realtime PCR对不同时期牛卵母细胞的cdc20mRNA水平进行检测，我们发现：cdc20mRNA在整个减数分裂过程中都存在，从GV~pre-MⅠ期升高，pre-MⅠ期cdc20mRNA水平最高，到2-细胞期最低。
2.提取牛皮肤成纤维细胞总RNA，并通过RT-PCR扩增牛cdc20基因，构建其真核表达载体pcdc20-venus。通过脂质体2000将pcdc20-venus转染Hela细胞，其蛋白在细胞核周围弥散分布。
3.将pcdc20-venus通过酶切线性化后体外转录为cdc20-venus mRNA后显微注射到成熟培养8-10h的牛卵母细胞内。通过实时监控发现：外源CDC20蛋白在mRNA注射后慢慢开始积累，在注射mRNA后1-2h合成速度最快，从2-5h有较慢的合成，约在4h到达平台期。
4. cdc20-venus mRNA注射后荧光在整个卵母细胞内都有分布，对牛卵母细胞第一极体排出率无显著变化(P＞0.05)。向成熟培养8-10h的牛卵母细胞内显微注射CDC20MO，CDC20MO组卵母细胞第一极体排出率极显著下降(P0.01)，而control MO组和对照组均无显著差异(P＞0.05)。通过免疫荧光染色发现实验组出现了异常的纺锤体和错误排列的染色体，大部分卵母细胞停滞在MⅠ期，而control MO组和对照组卵母细胞均无异常纺锤体出现。
5.对成熟的牛卵母细胞进行pcdc20-venus mRNA的显微注射，孤雌激活后继续培养72h，在每个卵裂球中细胞核处的荧光比胞质中强，其卵裂率无显著变化(P＞0.05)。对成熟的牛卵母细胞进行CDC20MO的显微注射，激活后孤雌胚胎的卵裂率无显著变化(P＞0.05)。
【关键词】：
【学位授予单位】：西北农林科技大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：Q813.7;S823【目录】：
摘要6-8ABSTRACT8-13第一部分 文献综述13-34 第一章 卵母细胞减数分裂机制研究进展13-24
1.1 减数分裂概述13-14
1.2 与卵母细胞减数分裂相关的复合物14-24
1.2.1 成熟促进因子14-18
1.2.1.1 MPF 的结构15
1.2.1.2 MPF 的功能15-16
1.2.1.3 MPF 活性的调节16-18
1.2.2 泛素-蛋白酶体复合体18-19
1.2.2.1 泛素-蛋白酶体的组成与功能 MPF 活性的调节18-19
1.2.2.2 泛素-蛋白酶体与细胞分裂19
1.2.3 后期促进复合物19-21
1.2.3.1 APC/C的结构与功能19-20
1.2.3.2 APC/C对底物的识别20
1.2.3.3 APC/C的调控20-21
1.2.4 纺锤体检查点21-24
1.2.4.1 纺锤体检查点结构与功能21-23
1.2.4.2 异常的纺锤体检查点23-24 第二章 CDC20研究进展24-34
2.1 CDC20概述24-26
2.1.1 CDC20的结构与功能24-26
2.2 CDC20与有丝分裂26-27
2.3 CDC20与卵母细胞减数分裂27-28
2.4 CDC20与肿瘤发生28
2.5 CDC20表达与调控28-34
2.5.1 CDC20的表达28-29
2.5.2 CDC20与 APC/C29-30
2.5.3 CDC20与纺锤体检查点30-31
2.5.4 CDC20与 Emi 1 和 Emi 231-33
2.5.5 CDC20的其他调控33-34第二部分 试验研究34-65 第三章 牛 cdc20基因克隆及其真核表达载体构建34-42
3.1 材料与方法34-38
3.1.1 仪器设备34-35
3.1.2 材料和试剂35-38
3.1.2.1 牛 cdc20基因克隆及序列鉴定35-36
3.1.2.2 pcdc20-venus真核表达载体构建36-37
3.1.2.3 pcdc20-venus转染 Hela 细胞37
3.1.2.4 RT-PCR 鉴定 pcdc20-venus在 Hela 细胞表达情况37-38
3.2 结果与分析38-40
3.2.1 cdc20基因的克隆与载体构建38-40
3.3 讨论40-41
3.4 小结41-42
3.4.1 cdc20基因克隆与真核表达载体构建41
3.4.2 pcdc20-venus质粒转染 Hela 细胞41-42 第四章 mRNA 的制备及 Morpholino 干扰效率测定与牛卵内源 mRNA 检测42-50
4.1 材料与方法43-45
4.1.1 仪器设备43
4.1.2 材料和试剂43
4.1.3 cdc20-venus与 venusmRNA 的制备43
4.1.4 牛卵母细胞培养43-44
4.1.5 实时定量 PCR 测定牛卵内源性 mRNA44
4.1.6 显微注射44-45
4.1.7 数据统计45
4.2 结果与分析45-48
4.2.1 体外培养不同时期卵母细胞中 cdc20mRNA 水平测定45-46
4.2.2 cdc20-venus与 venusmRNA 的制备46
4.2.3 cdc20-venus与 venusmRNA 在牛卵母细胞中的表达46-47
4.2.4 Morpholino 的干扰效率47-48
4.3 讨论48-49
4.4 小结49-50
4.4.1 体外转录制备 mRNA49
4.4.2 体外转录产物向卵母细胞的注射49
4.4.3 干扰效率测定49-50 第五章 异常表达 cdc20对牛卵母细胞对第一极体的排出的影响50-59
5.1 材料与方法50-51
5.1.1 仪器设备50
5.1.2 材料和试剂50
5.1.3 牛卵母细胞培养50
5.1.4 显微注射50-51
5.1.5 数据统计51
5.1.6 免疫荧光染色51
5.2 结果与分析51-55
5.2.1 mRNA 在卵母细胞内的表达情况51-52
5.2.2 超表达 cdc20对第一极体排出率的影响52-53
5.2.3 干扰 cdc20对第一极体排出率的影响53-54
5.2.4 干扰 cdc20对纺锤体影响54-55
5.3 讨论55-58
5.4 小结58-59
5.4.1 超表达 cdc20对第一极体排出率的影响58
5.4.2 干扰 cdc20使第一极体排出率极显著下降58
5.4.3 干扰 cdc20使纺锤体受损58-59 第六章 异常表达 cdc20对牛卵母细胞卵裂的影响59-65
6.1 材料与方法59-61
6.1.1 仪器设备59
6.1.2 材料和试剂59
6.1.3 牛卵母细胞的培养59
6.1.4 显微注射59-60
6.1.5 孤雌激活及孤雌胚胎培养60
6.1.6 Hoechst33342染色观察60-61
6.1.7 数据统计61
6.2 结果与分析61-64
6.2.1 超表达 cdc20 对卵裂率的影响61-62
6.2.2 干扰 cdc20 对卵裂率的影响62-64
6.3 讨论64
6.4 小结64-65
6.4.1 超表达 cdc20 对卵裂率的影响64
6.4.2 干扰 cdc20 对卵裂率的影响64-65结论65本研究的创新点与进一步研究的课题65-66参考文献66-75缩略词对照75-76致谢76-77作者简介77-78
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京公网安备74号精神分裂症的诱因是什么呢|精神分裂症的种类会是什么呢
精神分裂症的种类会是什么呢
生活需时时刻刻警惕精神分裂症的危害，提前预防和了解很有必要。图老师小编下面给大家介绍精神分裂症的种类会是什么呢，关注健康，珍爱身体！
精神分裂症的诱因是什么呢
在我们国家的发病率是非常高的，有越来越多的人出现了精神分裂症的症状，当这种疾病发生以后，会让我们的性格出现严重的变化，而且带给我们很多的伤害，到底有哪些病因会诱发精神分裂症出现呢，往下看了解一下吧。
精神分裂症的病因：
1.精神分裂症患者亲属患病的危险度，据研究，在一般人群中精神分裂症终生预期患病率为0.80%，但精神分裂症患者亲属的终生预期患病率则远较一般人群为高，双亲患精神分裂症的子女终生患病率为46.3%，双亲之一患病时子女终生患病率为16.7%，精神分裂症患者兄弟姐妹之预期危险度为10.1%。在二级亲属和三级亲属中，预期危险度分别是3.3%和2.4%。总之，血缘关系越远患病的危险度越低。
2.双生子研究，单卵双胎精神分裂症的同病率为35%～58%，双卵双胎精神分裂症的同病率为9%～26%。另据研究，生后不久即分开养育的单卵双胎孪生子17对中有11对也同时发生了精神分裂症。
3.寄养子研究，hestou与denney(1968)随访若干患慢性精神分裂症母亲的子女共47人。这些人出生后两周即寄养于他人家庭，另外又以50名出生于精神正常母亲作为对照组。在观察组中的47人，有5人患精神分裂症;对照组中则没有。此外，观察组中发生精神异常、社会功能欠缺、神经症患者以及犯罪入狱者也较对照组为多。另有研究表明，同类的观察组终生患病率为9.4%，对照组为1.2%。
精神分裂的症状
一、个性改变：一些逐渐起病的患者，精神活动逐渐变得迟钝，与亲人疏远，平时一向孝顺的孩子变得不关心亲人。日常人际交往变少，平日沉默寡言，孤僻、懒散，不注意个人卫生，很多人工作或学习的效率低下。常常被误认为性格内向，不思进取，很容易被忽视。
二、类表现：很多患者最初出现的失眠，常逐渐或突然变得难以入睡、易惊醒或睡眠不深，多梦。有些则表现为头疼、，或有强迫症状群，如怕脏、怕高，无端的恐惧、紧张等，这些表现往往带有荒谬离奇性，但患者常无主动求治的愿望。
三、意志明显减退：与原来积极、勤奋上进的状态不同，逐渐变得工作马虎，不负责任，甚至旷工、旷课;或生活变得懒散，不修边幅，无任何进取心，得过且过的混日子。对学生来说无任何原因导致学习成绩明显下滑要特别引起家长的注意。
四、其他表现：零星出现不可理解的行为，有时突然冲动，变得多疑，存在片段的不可理解的想法或偶尔的幻觉，对某个身体部位的不合理地关注，对亲少年来说如特别关注自己容貌、身高、肤色、眼睛大小等，而且对家长的解释不接受。
通过上述的内容，我们了解到了精神分裂症的诱因有哪些了，希望朋友们要多关注精神分裂症才行，而且还要多注意自己的心情，如果感觉到自己的心情不畅的话，一定要及时的进行排解自己内心的压力，要注意自己的饮食。
精神分裂症的种类会是什么呢
我们的身边已经有很多的人受到了精神分裂症的困扰，伤害到了患者的身心健康，精神方面也明显的异常，此病的类型有很多，这是较多朋友并不了解的知识，下面图老师小编为朋友们介绍一下精神分裂症疾病的类型会有哪些呢。
一、青春型，本型在精神分裂症的类型中较为多见。多发病于青春期，起病较急，病情发展较快。主要症状是思维内容离奇，难以理解，，情感，表情做作，弄鬼脸，傻笑。行为幼稚、愚蠢、零乱，精神症状丰富易变。此型病程发展较快，虽可自发缓解，但维持不久，易复发。抗精神病药物系统治疗和维持治疗可延长缓解期，减少发病。
二、偏执型，偏执型精神分裂症起病年龄较其它各型为晚。病初表现为敏感多疑，逐渐发展成妄想，并有泛化趋势，妄想内容日益脱离现实。有时可伴有幻觉和感知觉综合障碍。情感和行为常受幻觉和妄想支配，表现多疑、多惧，甚至出现自伤及伤人行为。此型是临床上最为常见的精神分裂症的类型。病程发展较其它类型缓慢，精神衰退现象较不明显，自发缓解者较少，但经治疗则收效较好。
三、单纯型，本型较为少见。多数青少年时期起病，起病缓慢，持续进行，表现为：孤僻、被动、活动减少等情形日益加重，并日益脱离现实生活。临床症状主要为：逐渐发展的人格衰退。一般无幻觉和妄想，如有则多为片断或一过性。此型患者在发病早期常不被人注意，往往经过数年的病情发展到较严重时才被发现。此型自动缓解者少，治疗效果和预后较差。
四、紧张型，患者大多数起病于青壮年时期，起病较急，病程多呈发作性，主要表现为和紧张性兴奋，两者交替出现，或单独发生。最主要表现是紧张性木僵，患者不吃、不动也不说话，如泥塑木雕或如蜡像一般，可任意摆动其肢体而不作反抗，但意识仍然清醒。有时会从木僵状态突然转变为难以遏制的兴奋状态，这时行为暴烈，常有毁物伤人行为，一般数小时后可缓解，或回复进入木僵状态，但严重时可昼夜不停。紧张型精神分裂症的类型在临床治疗中有可能自动缓解，治疗效果较其它型好。
五、其它型，精神分裂症的类型除了上述列举的四种外，还有未分型，是指多种症状交叉混合，很难归入上述任何一型的精神分裂症。虽然国际精神科医学专家还未能正式确定精神分裂症的类型，但总体上各国专家都是围绕上述五种精神分裂症的类型来研究和医治的。因此，无论是精神分裂症患者自己还是医疗工作人员一定要认识并分清该病的各种类型，对症治疗才能取得最佳疗效。
在认识了相关的内容之后，相信大家对于精神分裂症的类型十分清楚了，精神分裂症会让患者朋友陷入到困扰当中，带给他们较多的心理方面的障碍，波及到了生活，所以说要将此病的类型引起重视，注意做好此病的预防才可以。
精神分裂症的症状主要会是什么呢
精神分裂症是一种特别可怕的疾病，往往会因为遭受过严重的打击和刺激而发病，患病之后患者的思想就会特别的反常，经常会出现一些奇怪的想法，发病后的症状特别的多，让我们来了解一下该病的相关症状主要有哪些。
第一点：妄想。在精神病领域，尤指难以纠正的病态信念，与现实不符，与个人处境和文化中公认的信念也不一致。原发性妄想按本人的生活经历和人格是无法理解的;继发性妄想在病态心理学上可以理解，它源于其他精神症状或障碍，如或牵连观念。
第二点：思维散温。对精神分裂症来说，最明显的论证之一是精神分裂症者说话漫无边际。前言不搭后语，特别体现在年轻患者的身上。正常的说话是沿着一条思维活动轨迹进行，各种想法观察家间存在着逻辑性的联结。相比，精神分裂症患者说话时经常出现联想散漫，想法会从一条思维转向另一条思维，结果是说话内容越来越游离于主题之外。病情严重时，语句之间便毫无相干。
不过，这并不是说的精神分裂症患者不能对一个问题作出直接的回答。他们和正常人一样能无困难地对给定的刺激做出非常常见的一级联想。许多精神分裂症患者在进行比较微妙的二级联想时，就会产生令人疑惑毫无关系的联想。
第三点：在表达方式上的混乱。在精神分裂症患者的言变速器，有时会发现他们往往会语词新作。精神分裂症患者令人疑惑的言语通常被看作是思维混乱的产物。然而，一些研究者认为，精神分裂症型言语中那些奇怪的现象可能并不是由明显的思维活动障碍所导致的，而仅仅因为他们无法提取通常已经被公认的语言符号。也就是说，精神分裂症患者要说的东西可能足够的合理，他们只是找不到合适的词来表达。
通过以上内容的了解，我们很清楚的知道了精神分裂症的症状有哪些了，当知道了该病的症状之后，我们又加深了对于该病的了解和认识，在生活当中我们一定要重视该病，平时做一些预防工作，要让自己的心态保持平和。
精神分裂症的危害会是什么
很多的朋友在出现了精神分裂症的症状以后，就会感觉到异常的痛苦，他们表现的就会特别的异常，而且精神状况特别的不好，此我们带来很严重的危害，在这里图老师小编就来介绍一下精神分裂症的相关危害主要是什么呢。 精神分裂症的危害： 1、严重的妄想情况，病人把自己思想上认为的东西，当成了真实情况，无论其事物是否真实存在，对于病人来说，他想的、他认为的就是真实存在，即妄想。较好的情况是导致病人对自己妄想的真实逃避、害怕、恐慌等负面情绪，将自己迷失在一个半真半假或者是完全虚假的世界，对病情的发展只有负面影响。而较坏的情况，则是精神病人把其他人妄想成要对自己不利或者自己仇恨的人，对假想敌进行攻击伤害，以此来保护自己，这样很容易导致悲剧的发生。 2、，冲动伤人，对亲人不理睬，生活自理能力低下、不讲卫生、言语缺乏、不与人交往等。发病时狂燥不安、抑郁、幻听幻觉、敏感多疑、、胡言乱语、乱摔东西、冲动伤人、不能控制自己等。 3、严重者可导致自杀或是伤人，因为病人精神方面的受创，很难分辨幻听是否真实。更甚者，对幻听的内容是绝对服从，即便是叫他去自杀、伤害他人等恶性行为，他都毫不犹豫的去做。而且，因为幻听的突然性，病人的行为也是毫无征兆，觉得是该做的，他就会付诸行动，叫人无法预防。幻听对病人自杀，做出的贡献不小。 精神分裂症的症状表现： (1)感知觉障碍，精神分裂症可出现多种感知觉障碍，最突出的感知觉障碍是幻觉，包括幻听、幻视、幻嗅、幻味及幻触等，而幻听最为常见。 (2)思维障碍，思维障碍是精神分裂症的核心症状，主要包括思维形式障碍和思维内容障碍。思维形式障碍是以思维联想过程障碍为主要表现的，包括思维联想活动过程(量、速度及形式)、思维联想连贯性及逻辑性等方面的障碍。妄想是最常见、最重要的思维内容障碍。 (3)情感障碍，情感淡漠及情感反应不协调是精神分裂症患者最常见的情感症状,此外，、易激惹、抑郁及焦虑等情感症状也较常见。 (4)意志和行为障碍，多数患者的意志减退甚至缺乏，表现为活动减少、离群独处，行为被动，缺乏应有的积极性和主动性，对工作和学习兴趣减退，不关心前途，对将来没有明确打算，某些患者可能有一些计划和打算，但很少执行。 了解到了上述的这些介绍之后，相信各位朋友对于精神分裂症的危害了解的相当透彻了，精神分裂症在精神疾病特别的严重，所以朋友们是需要加以关注的，而且要让自己的生活质量得到提高，要注意加强一些体育锻炼才行。
诱发精神分裂症的原因会是什么
精神分裂症在精神疾病当中相当的严重了，而且危害到很多朋友的健康，当前可以诱发精神分裂症出现的原因特别的多，朋友们需要将精神分裂症的诱发因素加以关注才行，究竟是什么样的原因诱发了精神分裂症的出现呢。
精神分裂症的诱发原因：
一、遗传因素，根调查，发现本病患者近亲中的患病率比一般居民高数倍。与患者血缘关系越近，精神分裂症的发病率越高。有关孪生子的研究预告，本病单卵孪生的同病率比双卵孪生一般高4~6倍，寄养子也是如此。关于遗传途径，目前多处于假设阶段，许多作者倾向于多基因遗传，即疾病是由于几对致病基因和环境因素共同作用而起病。近几年由于分子遗传学的进展，英国科学家在精神分裂症家族聚集性较明显的家系中进行研究，提示本病的病理基因位于第5对染色体，引起精神学界的重视。目前对精神分裂症的基因定位研究，尚无定论。但能肯定其遗传倾向。
二、躯体生物学因素，精神分裂症(15张)在母孕期受到病毒感染的胎儿，其成年后发生精神分裂的机率明显高于对照组，孕期及围产期的合并症，也使本病的发病率提高。
三、内分泌因素，本病大多在青春期前后性成熟期发病，部分病人在分娩后急性起病。此外，本病发病率在绝经阶段也较高。以上临床事实说明内分泌在发病中具有一定作用。甲状腺、性腺、肾上腺皮质和垂体功能障碍，也曾被不少学者疑为本病的病因。但有关这些方面的研究未能作出肯定的结论。
精神分裂症的护理：
前期护理的重点是患者的情绪。这个时期，患者病情刚刚得以确定，很多患者不承认有病，不配合治疗，抵触情绪比较大。护理的目标是稳定患者情绪，看管好患者的病情变化，限制患者的活动范围，避免刺激性的事件再次伤害到患者。同时劝说患者愿意接受治疗，走上正式治疗的轨道。
中期是精神分裂症患者怎么护理的关键。这个时期的护理，目标是病情不复发。治疗的过程中，一定保持患者治疗的连续性，只有这样，患者的病情才能在治疗的过程中得到稳步的好转。并且这个病情好转的程度会越来越快速。
后期护理的侧重点是生活和认知功能的恢复。通过与外界接触时间和范围的扩大，提高患者重新进入社会的能力和意识。这对患者保证以后的生活和生存能力很有帮助。精神分裂症是种严重影响人们心智情绪的疾病，除了必要的治疗，护理的意义越来越凸显。
了解到了上面的相关知识之后，已经认识到了精神分裂症的诱发原因是什么了，精神分裂症不是普通的精神疾病，会让患者的精神受到影响，他们的情绪会特别的不固定，往往会做出一些特别恐怖的事情来，需要及时的治疗。
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