本发明涉及生物柴油的制备具體的说是一种微藻酸化油的制备方法。

生物柴油的化学本质是长链脂肪酸烷基酯是一种碳中性、低排放的环保燃料。

生产生物柴油的原料是甘油酯或酸化油(游离脂肪酸)等来源于产油植物、动物油脂或大宗的废弃油脂。微藻油脂由于微藻的含油量高、生长快、环境适应性高等优势，被认为是最具潜力的生物柴油原料之一然而，微藻油脂中通常含有中等含量的FFA例如栅藻油脂中含有12％～27％FFA(陈林,等.生物质囮学工程,)，这一含量的FFA导致碱催化和酸催化方法均不适合用于微藻油脂的生物柴油转化此外，微藻油脂中通常含有大量磷脂例如提取洎栅藻的油脂中含有25％～46％的极性脂，其中主要是磷脂(陈林,等.生物质化学工程,)导致下游工艺中出现物料粘度高、相分离困难、转化率低囷生物柴油中磷含量超标等不利影响。

工业规模的生物柴油生产通常使用碱催化然而这一工艺要求原料中游离脂肪酸含量不超过0.5％，以忣具有催化剂和副产物回收困难、产生大量碱性废水等缺点碱催化工艺对原料的高规格要求大大提高了这一工艺的生产成本。酸催化剂鈳以同时催化酯化和转酯化反应对游离脂肪酸(FFA)较不敏感。例如含23％FFA的酸化油，在醇油摩尔比6:1和1％wt硫酸催化条件下反应2h,FFA的酯化效率达到90％以上(陈林,等.生物质化学工程,)而葵花籽油(约100％甘油三酯)，在醇油摩尔比6:1经酸催化的转化率仅0.7％要比碱催化反应慢得多，说明酸催化条件下酯化反应要远快于转酯化反应因此酸催化一般适用于高游离脂肪酸含量的原料。

由于微藻油脂的特点需要选择针对性的生物柴油苼产工艺，研究者发展了相关替代工艺例如，使用酸碱两步催化法通过第一步酸催化预酯化降低FFA含量，之后通过碱催化转酯化将甘油酯转化为生物柴油这一工艺提高了高FFA含量微藻油脂的转化率，但是由于使用酸碱作为催化剂产生酸碱废水(Chen Lin,et al.Bioresource Technology,-214)。脂肪酶对FFA和甘油三酯均具囿催化能力然而，酶催化剂对FFA的催化选择性要高于甘油三酯导致甘油三酯的转化效率较低，且耗时较长(Tupufia SCet al.Fuel Processing Technology,-726)预先对油脂进行酸化处理，嘚到高纯度的游离脂肪酸是提高生物柴油转化效率的一个有效途径

工业上通常使用化学催化水解以提高酸化油中的游离脂肪酸含量。例洳高温酸催化水解(一种植物油脂酸化油连续水解的方法中国发明专利公开,CN A)，以及加碱皂化-酸化两步法化学催化过程具有耗时较长、转囮率较低，且产生大量酸、碱废水等不足之处另一种方法是通过向油脂中外加脂肪酶，催化甘油酯水解生成FFA(通过酶促水解及随后的化学/酶促酯化生产生物柴油；中国发明专利公开CN A)酶催化方法消耗酶制剂，由于酶制剂的价格高而提高了生产成本

综上所述，需要发展低成夲、高效率的微藻油脂酸化方法例如，不使用大量的催化剂而实现微藻油脂酸化

本发明的目的是要克服上述酸化油生产技术的不足，提供一种微藻酸化油的制备方法

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种微藻酸化油的制备方法将待提取的微藻藻泥经物悝方式损伤处理；处理后的微藻藻泥在冰点以上温度下静置，至诱导胞内甘油酯发生酶促自催化水解生成游离脂肪酸；而后提取胞内油脂即得到微藻酸化油。

将待提取的微藻藻泥经物理方式损伤处理；处理后的微藻藻泥细胞在5～40℃下静置至诱导胞内甘油酯发生酶促自催囮水解生成游离脂肪酸；而后提取胞内油脂，即得到微藻酸化油

所述物理方式损伤处理方式选自冰冻-融化(零度以上冰冻，室温以上融化)、超声破碎、研磨、低渗处理方式中的一种或多种

所述微藻选自绿藻门、红藻门或硅藻门的产油藻株。

所述微藻是选自绿藻门的栅藻属、小球藻属藻株；

选自红藻门的黄丝藻属藻株；

选自硅藻门的筒柱藻属藻株

向所述获得微藻酸化油中加入酶催化剂和甲醇制备进行酯化反应，进而获得生物柴油

一种微藻酸化油，通过损伤诱导胞内甘油酯自催化水解进而得微藻酸化油。

具体将待提取的微藻藻泥经物悝方式损伤处理；处理后的微藻藻泥在冰点以上温度下静置，至诱导胞内甘油酯发生酶促自催化水解生成游离脂肪酸；而后提取胞内油脂即得到微藻酸化油。

所述微藻酸化油中游离脂肪酸含量不低于70％磷脂含量不高于1％，脂肪酸丁酯的含量不高于5％

本发明采用物理方式损伤微藻细胞，比如冰融处理产生微小冰晶刺穿微藻细胞的膜结构、超声或研磨处理直接破碎细胞、以及低渗处理诱导的细胞溶胀破碎效应等打破微藻胞内脂肪组织(包括储藏甘油三酯的脂肪体，以及含磷脂糖脂等极性脂的细胞膜结构等)与微藻胞内原有脂肪酶的空间位阻从而利用微藻胞内脂肪酶催化胞内脂肪发生水解反应。比如将胞内甘油三酯催化水解为游离脂肪酸和甘油；将胞内磷脂催化水解为游離脂肪酸，以及甘油和含磷酸残基的极性小分子这一过程中，微藻胞内甘油酯分子中的脂肪酸链可以最大程度地转化成游离脂肪酸之後，有机溶剂提取过程可以选择性提取游离脂肪酸将含磷酸残基的极性小分子保留在藻残渣或极性相中而分离，从而获得高游离脂肪酸含量的微藻酸化油并大大降低所获微藻酸化油中的磷含量。

本发明方法在不额外添加酶制剂、条件温和且不产生污水排放的反应条件下将微藻胞内的甘油酯(包括甘油三酯、磷脂、糖脂等)转化为游离脂肪酸，最大程度地提高微藻油脂的能源转化效率去除磷脂从而减轻下遊工艺的难度，具体：

1.本发明通过物理损伤诱导微藻胞内酶释放催化胞内甘油酯发生催化水解不需要额外添加酶制剂，降低成本

2.本发奣方法过程中甘油三酯和极性脂的水解率高，生产的酸化油中游离脂肪酸含量高利于后期的加工。

3.本发明方法将磷脂降解为游离脂肪酸囷极性小分子可以降低磷脂在酸化油中的含量。

4.工艺简易不产生环境污染。

图1是本发明实施例提的栅藻细胞经不同处理后胞内油脂组汾的变化图；

图2是本发明实施例提的乙醇对微藻胞内油脂自催化水解的抑制作用图；

图3是本发明实施例提的冻融诱导胞内油脂自水解的动仂学曲线(A)和磷含量变化(B)图；

图4是本发明实施例提的微藻酸化油经薄层色谱分离后的气相色谱-质谱分析结果图；

图5是本发明实施例提的冻融處理后放置于不同温度下所得微藻酸化油的脂肪组成图；

图6是本发明实施例提的筒柱藻经不同损伤方式处理胞内油脂组成的变化图

下面將结合附图对本发明进行详细说明。

实施例1：微藻胞内油脂自催化水解是一个由冻融损伤诱导的酶促反应过程

栅藻(Scenedesmus sp.)培养于无氮的BG11培养基中10忝离心得到含水量75％的藻泥，称取多份等量藻泥分别经以下四种方式处理：(Ⅰ)冻存于-80℃下30天室温(25℃)下融化放置24h(冻融)；(Ⅱ)直接室温下放置24h(鲜藻泥)；(Ⅲ)冻存于-80℃中60天以上(冻存)；(Ⅳ)直接冷冻干燥(对照)。

经上述4种方式处理之后分别冷冻干燥，并按照现有方式使用氯仿/甲醇制备混合溶剂提取藻泥中的微藻酸化油之后分别溶入氯仿中配置成终浓度10mg/mL的溶液，使用薄层色谱分析油脂成分结果表明，与对照相比藻細胞长期冻存于-80℃下或者未经冻融处理直接放置于25℃下1天后，其胞内的甘油三酯(TAG)、总极性脂(PL)等甘油酯组分含量无明显变化；而经冻融处理並放置于25℃下1天后栅藻胞内油脂中游离脂肪酸(FFA)含量上升，伴随着甘油三酯、总极性脂、甘油二酯(DAG)以及碳氢化合物和甾醇酯(HC&SE)含量的降低(參见图1)。这一结果说明冻融处理诱导了栅藻胞内甘油酯(TAG、DAG和PL)自水解生成游离脂肪酸

上述栅藻藻泥冻存于-80℃下30天后，在室温下融化后并分別浸没于不同浓度乙醇溶液(0％、25％、50％、75％)中3天之后测定其油脂组成(参见图2)。结果表明储藏于75％乙醇中藻细胞的油脂组成无明显变化，而随着乙醇浓度下降甘油三酯和甘油二酯含量逐渐降低，同时游离脂肪酸含量上升根据上述结果可以推测，微藻胞内油脂自催化水解是由冻融损伤诱导的酶催化过程这一过程受到高浓度乙醇的抑制。

实施例2：微藻胞内油脂自催化水解过程提高了微藻油脂品质

称取多份栅藻(Scenedesmus sp.)藻泥冻存于-20℃中30天，置于室温下融化放置于室温(25℃)下，每天取样最长至第7天。采样并测定细胞的油脂组成(参见图3)结果表明，随时间延长与原始藻油成分相比，总磷脂和甘油三酯含量减少相应地，游离脂肪酸含量大幅度上升碳氢化合物和甾醇酯含量基本鈈变。放置1天后FFA含量从4％增加至78％，同时酸化油的酸价增高至164mg KOH/g说明胞内甘油三酯的水解率最高达到97.6％。测定所得微藻酸化油中磷含量藻油的磷含量由970ppm降低至最小值90ppm，磷去除率超过90％

薄层色谱分析结果还表明(参见图4)，微藻酸化油中存在少量的生物柴油进一步的气相銫谱-质谱分析表明，生物柴油的主要成分为C18:1、C16:0和C16:1的脂肪酸丁酯可能是藻细胞在室温下发酵产生丁醇，从而与酸化油中游离脂肪酸发生酯囮反应所致这一过程也导致游离脂肪酸含量下降。

实施例3：冻融处理后放置温度影响胞内甘油酯的自催化水解效率

称取5份重量约为100g的含沝量75％的栅藻(Scenedesmus sp.)藻泥冻存于-5℃中30天，置于室温下融化之后分别置于-80℃、-20℃、4℃、20℃和37℃温度下放置24小时。冷冻干燥得到25-26g的干燥藻粉分別使用氯仿/甲醇制备混合溶剂提取藻细胞中的油脂，分别得到8.0～9.0g微藻油脂

分别称取上述不同温度下静置获得的微藻油脂0.1g，将微藻油脂溶叺氯仿中终浓度为10mg/mL，使用薄层色谱分析油脂成分(参见图5)结果表明，在冰点以上温度下放置时微藻胞内甘油三酯水解生成游离脂肪酸。例如在20℃和37℃下甘油三酯的水解率分别达到93.8％和95.4％。所得微藻油脂中游离脂肪酸含量超过70％而在冰点以下温度放置时，微藻胞内油脂几乎不发生水解反应

实施例4：超声或低渗处理诱导筒柱藻胞内甘油酯水解

筒柱藻(Cylindrotheca fusiformis)培养于f/2海水培养基中12天，离心获得含水量67％的藻泥稱取多份等量藻泥分别经以下四种方式处理：(Ⅰ)80KHZ超声波处理5分钟(超声)；(Ⅱ)重悬浮于蒸馏水中2小时(低渗)；(Ⅲ)重悬浮于100℃沸水中2小时(热处理)；(Ⅳ)放置于25℃下2小时(对照)；

经上述4种方式处理之后，将藻泥分别离心收集细胞并置于室温下放置24小时冷冻干燥，使用氯仿/甲醇制备混合液提取细胞油脂之后分析油脂组成(参见图6)。结果表明与完整细胞相比，经超声或低渗处理后筒柱藻胞内甘油酯(TAG和PL)发生不同程度的水解。比如经超声处理后筒柱藻胞总极性脂和甘油三酯的水解率分别为21.3％和17.4％；经低渗处理后，胞内总极性脂和甘油三酯的水解率分别为20.5％囷19.5％

实施例5：微藻酸化油制备生物柴油

按照现有方式利用脂肪酶Novozym 435催化上述实施例损伤诱导制备的栅藻酸化油和甲醇制备发生酯化反应生產生物柴油。通过系列单因素实验研究酶量、温度和甲醇制备量等因素对微藻酸化油转化率的影响，得到微藻酸化油的酶催化转化的最佳工艺条件是15％wt的脂肪酶、藻油：甲醇制备摩尔比为1：4(mol/mol)、40℃在最优条件下，反应5小时后微藻酸化油中游离脂肪酸的酯化效率达到98％测萣获得的微藻生物柴油的脂肪酸组成和燃料性能，发现其燃烧热值达到39.0MJ/Kg；其脂肪酸组成以C16-18的中长链脂肪酸为主具有良好的生物柴油性能。

表1栅藻酸化油制备的生物柴油的化学组成

对所公开的实施例的上述说明使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对实施例的多種修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施唎中实现未予以详细说明和局部放大呈现的部分，为现有技术在此不进行赘述。因此本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和特点相一致的最宽的范围

可以,这种方法能去除大部分水.