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荧光探针Fluo-3/AM和FuraRed测量单细胞中比率钙
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荧光探针Fluo-3/AM和FuraRed测量单细胞中比率钙
中国医学物理学杂志1999年第3期第16卷实验研究作者：马晓冬朱晓亮赵　清张　瑾张　飒雷国华黄行许鲍永耀单位：马晓冬赵　清张　瑾张　飒雷国华黄行许鲍永耀（第一军医大学中心实验室）；朱晓亮（南方医院皮肤科,广东广州510515）关键词：激光扫描共聚焦显微镜；Fluo-3/AM；FuraRed；比率钙...
摘要：应用ACAS570激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM简称共焦显微镜）和钙离子指示剂Fluo-3/AM 、FuraRed荧光探剂双标记技术，测定了单个活细胞内比率钙的动态变化。结果显示37 ℃, Fluo-3/AM浓度10 &mol/L，FuraRed浓度10 &mol/L的条件下，昆明小鼠巨噬细胞负载1 h左右即可获良好的标记效果。用比率探针测量细胞内Ca2+的动态变化，使Ca2+的定性定量测定不受染料浓度、细胞大小、照射光强度以及一定程度的光漂白和染料泄漏等因素的影响，提供了一种准确定性定量细胞内Ca2+的实时、动态、原位变化的新方法。
　　中图分类号：Q74　文献标识码：A　　文章编号：X（0－03
Ratiometric calcium measurements in single cells with visible wavelength probes fluo-3/AM and furared
MA Xiao-donget al.
　　First Military Medical University,Central Laboratory,,
　　ZHU Xiao-liang
　　Department of Dermatology of Nanfang Hospital , Guangzhou 510515,China
　　Key words：laser scanning
fluo-3/AM; ratiometric calcium.
　　细胞内游离Ca2+不仅作为一种重要的第二信使广泛参与细胞的运动、分泌、代谢和分化等多种细胞功能活动的调节[1]；而且胞内游离Ca2+浓度的变化与调控对于参与维持存在于细胞质膜或细胞器膜两侧的跨膜Ca2+梯差，介导细胞对外界刺激的应答反应具有重要的调节作用[2-4]。因此，在完整细胞上准确测定胞内游离Ca2+浓度的动态变化，其重要性是显而易见的。本文利用ACAS570激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM），采用单激发单发射指示剂Fluo-3/AM和FuraRed双标记法测定了外源性刺激剂地塞米松诱导胞浆游离Ca2+的动态变化，获得了良好的测定效果。
　　1　材料与方法
　　（1）：①地塞米松，用不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制，RPMI1640培养基（Gibco， 德国），小牛血清（Gibco,德国）。②Fluo-3/AM（biotium公司） 、FuraRed（Molecular Probes Inc,USA）用二甲基亚砜配成1 mmol/L，置于-20℃冰箱保存，PluronicF-127（biotium公司）。③不含Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液（g/L）: 8.01 gNaCl、Na2HPO4.12H2O、0.23 g NaH2PO4.2H2O。④Hepes缓冲液。⑤昆明种雄性小鼠（第一军医大学动物所提供）腹腔巨噬细胞培养。
　　（2）仪器：ACAS570激光扫描共聚焦显微镜（Meridian,USA）
　　1.2　方法
　　（1）巨噬细胞培养
　　18～20 g雄性昆明小鼠，按1次/天，1 ml/次连续三天腹腔注射1%巯基乙醇酸钠，停一天，按鄂征等人的方法取腹腔巨噬细胞（台酚兰吞噬实验显示99％为巨噬细胞），以1&106个/ml接种于特制的Petri培养皿（Meridian，USA）,用含10％小牛血清的RPMI-1640培养于37℃，含5％CO2孵箱内。2 d后即可进行实验。
　　（2）荧光探针标记
　　将培养2 d的小鼠腹腔巨噬细胞用Hepes缓冲液漂洗3次，滴入终浓度为10 &mol/L的Fluo-3/AM 和FuraRed，加入1 &l 25％ pluronic F-127，在37 ℃、5%CO2孵箱中孵育1 h，其间轻轻振荡几次，经Hepes缓冲液漂洗2次后，再滴入Hepes液0.5 ml。
　　（3）Ca2+动态变化的LSCM测定
　　LSCM由共聚焦显微镜主体，激光器（Ar+激光）和微型计算机构成。激光束的扫描与控制以及图像数据的采集和加工均由计算机完成。将标记好荧光探剂Fluo-3/AM和FuraRed的小鼠腹腔巨噬细胞，放入激光扫描共聚焦显微镜测定小室，用装有Olympus
　　IMT-2倒置相差显微镜和40&物镜ACAS570激光扫描共聚焦显微镜系统扫描成像。用488 nm氩离子激光同时激发两种染料，用ACAS570多彩色滤光盘（Molti-Color Filter Wheel）提供的530/30 nm带通滤光器和605 nm长通滤光器将两者的发射光分开，用有增辉电路的DageCCD摄像机，以1.0秒的间隔记录。数据通过图像采集器直接送入计算机，然后用ACAS570-IQ分析分析。
　　（1）用外源性刺激剂地塞米松测得巨噬细胞中Fluo-3和FuraRed对细胞内Ca2+的荧光强度变化曲线。在本实验中，将地塞米松（终浓度为1.5&M）加到巨噬细胞培养液中（100sec后），引起细胞内Ca2+迅速增加，随后逐渐达到平台。两种染料的荧光强度动态变化曲线清楚的表明，加地塞米松时（100sec）引发Fluo-3荧光急剧增强，同时伴有FuraRed荧光减弱，提示Ca2+增加（图1）。在加地塞米松前和Ca2+反应的峰值时，两种染料的相对荧光强度以灰度图表示（图2）。
　　图1　地塞米松刺激后，小鼠腹腔巨噬细胞负载Fluo-3/AM和FuraRed的荧光强度变化曲线检测器1（Det1）Fluo-3/AM通过530/30nm带能滤光器后单激发的荧光强度变化曲线检测器2（Det2） FuraRed 通过605 nm长通滤光器后单激发的荧光强度变化曲线
　　图2　地塞米松处理前，小鼠腹腔巨噬细胞负载Fluo-3/AM、FuraRed的荧光灰度图像（上图）和处理后小鼠腹腔巨噬细胞负载Fluo-3/AM、FuraRed的荧光灰度图像（下图）。检测器1（Detector1）表示负载Fluo-3/AM。检测器2（Detector2）表示负载FuraRed。　　（2）为了定量荧光变化，按实验中每个时间点求得Fluo-3/AM探针发射强度与FuraRed探针发射强度的比率。巨噬细胞对地塞米松反应的动态变化曲线表明，荧光比率迅速增加1.2倍，随后逐渐达到饱和状态（图3）。
　图3　地塞米松处理后，小鼠腹腔巨噬细胞负载
　　 Fluo-3/AM、FuraRed的比率荧光动态变化曲线
　　（1）在比率法中用两种染料同时标记，需要其比率在细胞内Ca2+浓度不变时保持稳定。两种染料的泄漏、区域化分布、漂白或代谢等均能导致实验过程中比率不稳定。Fluo-3/AM和FuraRed都对光漂白敏感，对经过10 &mol/LFluo-3/AM和10 &mol/LFuraRed孵育的巨噬细胞连续扫描，在本实验中地塞米松处理之前两种染料荧光强度的基线值（图1）及其比率荧光强度的基线值（图3）都是稳定的。这些结果表明：巨噬细胞中染料无预先发生的光漂白或泄漏；Fluo-3/AM和FuraRed用在比率法中是可行的。
　　（2）FuraRed是近年来研制的一种独特的Ca2+指示剂，发射640nm波长的荧光，荧光强度随FuraRed与Ca2+结合的增加而减弱[5,6]。相反Fluo-3发射530nm较短波长的荧光，荧光强度随Fluo-3/AM与Ca2+结合的增加而增强[7,8]。据此提供了一种定量细胞内Ca2+可见光激发的比率方法：将Fluo-3/AM和FuraRed联合使用，用488nm的可见光（激光）激发，来测定细胞内比率Ca2+的实时、动态变化。由于这两种染料与Ca2+结合发出的荧光量呈相反的变化，所以增加了对Ca2+检测的灵敏度。
　　（3）Fluo-3/AM和FuraRed都是很好的Ca2+指示剂。联合使用两种指示剂，用单一可见光激发能为用比率法测量细胞内比率Ca2+提供一种独特的有价值的方法。类似的比率测定法还有很多，如用两种染料同时测量Ca2+和pH[5,9]。但这些方法需要两种不同的荧光探针，而且须特别注意染料负载、光漂白和染料泄漏，每一种因素在各次实验之间可能明显地影响比率。使用Fluo-3/AM和FuraRed能提供一种Ca2+测量方法并具有可见光激发的优点。
　　参考文献：
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免费发布资讯大众医药网 - 文献资料 - 钙调蛋白参与Reuber肝癌细胞的池操纵钙内流
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钙调蛋白参与Reuber肝癌细胞的池操纵钙内流
　　福建医科大学学报1999年第33卷第3期
目的：通过钙调蛋白抑制剂来研究钙调蛋白在Reuber肝癌细胞池操纵钙内流的作用及其机制。 方法：以Reuber肝癌细胞系为材料，用钙离子回加技术、荧光显微镜技术以及加与不加钙调蛋白抑制剂来检测、定量该细胞系的钙释放、钙内流及钙内流速率。 结果：钙调蛋白参与Reuber肝癌细胞池操纵的钙内流。钙调蛋白抑制剂W13、W7、calmidazolium无论加在毒胡萝卜素(Tg)之前或之后，均能抑制由Tg引起的细胞钙内流。 结论：钙调蛋白参与Reuber肝癌细胞的池操纵钙内流。其机制可能是钙调蛋白参与肌醇三磷酸协调的Ca2+从内质网的释放或直接与膜上钙离子通道的通道蛋白接合而起作用的。
　　关键词：钙调蛋白　Reuber肝癌细胞(H4-ⅡE)　池操纵的钙内流
　　肝细胞是一类极化的上皮细胞，它在调节细胞各种生理机能上起到了极为重要的作用，包括新陈代谢、能量转化、合成、分泌蛋白质及胆汁酸等等。这些过程的进行和完成均受到激素的调控。激素在调节细胞生理功能的过程中，许多都以升高细胞质内游离钙离子浓度Ca2+］C作为细胞间的信号［1］。而细胞内游离钙离子浓度的改变也是一种动物细胞把信息从细胞外传到细胞内相关位点的主要方式。同时，Ca2+］C的变化强度、位置、持续的时间均代表细胞内钙离子的信号传递过程。而细胞内一定区域钙离子浓度的升高通常是由细胞外的信号分子(拮抗剂)结合到细胞膜的受体上从而引起信号传递的。在肝细胞中，Ca2+］C的升高可由钙离子从细胞外通过细胞膜进入胞质，或者可由Ca2+］从内质网中释放到细胞质中。对于细胞外钙离子的跨膜进入，可通过电压操纵的Ca2+通道(voltage-operated Ca2+ channels,VOCCs)，配体门控的非特异性离子通道(ligand-gated non-specific cation channels,LGCCs)和受体激活的Ca2+通道　　(receptor-activated Ca2+ channels,RACCs)［2,3］。由于RACCs分型多，每一种细胞又包含有许多种的RACCs，且每一种RACCs的生理功能、电生理特性、结构和激活机制上又都各自不同，因此，RACCs到目前还了解不清楚［4］。池操纵的Ca2+通道(store-operated Ca2+channels,SOCs)是至今研究最多、最热门、也最受重视的一个RACCs亚群。这种钙离子通道位于细胞膜上，该通道的打开是受内质网腔内的Ca2+浓度［Ca2+］er降低而引起的。在细胞的生理条件下，Ca2+］er的降低，可以导致肌醇三磷酸与肌醇三磷酸受体［Ca2+］通道结合，从而启动细胞膜上钙离子通道的打开。而这些钙离子通道的打开以及内质网膜上肌醇三磷酸受体与肌醇三磷酸的结合，均与钙调蛋白的作用有一定的关系［5］。因此，本文通过检测由毒胡萝卜素刺激引起的H4-ⅡE细胞钙释放及内流来研究钙调蛋白在其中的作用，以及试图对H4-ⅡE细胞膜上的钙离子通道的结构及属性进行研究。
　　1 材料与方法
　　1.1 药品与试剂
　　毒胡萝卜素(毒胡萝卜素，Tg)，calmidazolium,W7［N-6(-amino-hexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulphonamide］,W13［N-(4-aminobutyl)-5-chloro-2-naphthalenesulpho\|
　　namide］，离子霉素(ionomycin)，以上药品购自Sigma公司。其余常用化学药品与试剂来源同文献［6］。fluo-3 acetoxymethylester(fluo-3/AM)购自美国Molecular Probes公司。
　　1.2 细胞培养
　　H4-ⅡE细胞系(一种来源于Reuber大鼠肝癌细胞的永久细胞系，ATCC CRL 1548)在37℃　5％(v/v)CO2浓度于完全DMEM培养基(complete DMEM,cDMEM)置于CO2培养箱中培养。cDMEM含有100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，10 mmol肝素,pH 7.4，10％(v/v)小牛血清。因为该细胞系为贴壁生长的细胞，转种时用胰蛋白酶(0.1％w/v)和EDTA(0.2％w/v)进行洗脱细胞。
　　1.3 细胞内游离钙离子浓度、钙池内钙离子释放、钙内流速率的检测
　　实验时，选择不超过转种15代的H4-ⅡE\生长状态良好的细胞进行钙浓度的测定。(1)把细胞接种在有胶原蛋白包被的无菌圆玻片上(直径22 mm，每片约0.6×106个细胞)，置于37℃ 5％(v/v)CO2培养箱中培养使细胞在圆玻片上贴壁生长成铺满玻片的单层细胞后，进行细胞荧光染色。(2)细胞荧光染色时，把含有单层细胞的圆玻片置于含有40 μmol/L fluo-3/AM，0.05％(v/v)Pluronic F-127酸的cDMEM培养基中37℃5％CO2条件下培养约0.5 h。(3)染色后，细胞用改良的Krebs-Henseleit缓冲液mmol/L:NaCl 117,KCl 4.7，MgSO4 1.2，NaHCO3 24，TES 20，用KOH调整pH值至7.4),在室温下漂洗3次。(4)把含有单层细胞的圆玻片置于倒置的Nikon TMD-EF荧光显微镜下进行荧光检测与实验。在检测时，用40倍油镜头，细胞孵育室温度控制在34℃，用P1型光度仪(Nikon)，UMANS滤片转换器及电脑软件或者滤片轮(Sutter)，高密度CCD镜头(ISIS-3/S20，Photonic Science)和Axon成像工作平台(2.1版本)进行荧光测量。按公式算出细胞内游离钙离子浓度。Ca2+］C=(F-Fmin)/(Fmax-F)×400 nmol［7］。式中，F代表某一时刻的荧光强度，Fmin，Fmax分别代表细胞最小、最大荧光强度。对结果进行统计学处理。
　　细胞在检测钙离子浓度时，开始先置于无［Ca2+］的Krebs-Henseleit缓冲液中，测出细胞的基础荧光强度，然后，再用10 μmol/L Tg加入缓冲液，使细胞内钙离子从钙池中释放到细胞质中，加入Tg后与不加Tg前荧光强度值之差即表示释放出的Ca2+(图1)。待钙池中的钙离子释放之后，在细胞外加入过量的CaCl2(5 mmol/L)，进行钙内流及钙初始内流速率的检测(加钙离子的时间及长度如图1所示)。最后用10 μmol/L离子霉素 和20 mmol/L的乙二醇双（乙-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）溶于Tris碱（pH 8.8)校准实验得出最大、最小荧光强度。钙调蛋白抑制剂(W13，W7，calmidazolium)对Tg刺激的\{H4-ⅡE\}细胞钙离子浓度的变化和影响（如图1），指示出钙调蛋白抑制剂使用及维持的时间。
图1 W13抑制H4-ⅡE细胞中毒胡萝卜素（Tg）诱导的钙内流
　　a:W13加在Tg前；　B:W13加在Tg后；　箭头示加入钙离子或Tg；　图上方空心线条示加入W13.
　　2 结 果
　　H4-ⅡE细胞在用毒胡萝卜素（Tg）刺激之后，细胞的荧光强度产生一个峰值,代表细胞质内游离Ca2+浓度的升高(图1中上面的一条曲线)。由于此时在细胞外的缓冲液中并无Ca2+，因此，此时Ca2+浓度的升高，是由于细胞内质网内的钙池内的Ca2+释放到细胞质中。当在细胞外继续加入过量的Ca2+时，细胞外的Ca2+就通过细胞膜上的钙通道大量进入细胞质内，从而出现细胞荧光强度快速产生另一个峰值(图1中上面的一条曲线)。由Tg刺激引起的H4-ⅡE细胞的钙释放、钙内流及其初始钙内流率见附表。
附表 钙调蛋白抑制剂毒胡萝卜素诱导的Ca2+从钙池释放及钙内流（x±s）
钙调蛋白抑制剂
钙调蛋白抑
　　制剂浓度
　　（μmol/L）
毒胡萝卜素
　　诱导的钙释放
　　（nmol/L）
毒胡萝卜素诱导的钙初始内流速率
　　（nmol?L1.s11）
抑制剂加于
　　毒胡萝卜素之前
抑制剂加于
　　毒胡萝卜素之后
197±8(13)
4.2±0.1(13)
4.2±0.1(13)
1.9±0.04(5)*
0.4±0.1(3)*
1.6±0.13(5)*
1.1±0.11(5)*
Calmidazolium
289±17(8)
5.9±0.2(8)
5.9±0.2(8)
3.4±0.07(4)*
118±8(6)*
2.4±0.1(6)*
189±14(5)*
0.9±0.04(5)*
3.5±0.4(5)*
统计学处理的差异程度由加与不加抑制剂组进行不均衡t检验，*：P＜0.001.　　当在Tg刺激H4-ⅡE细胞之前加入钙调蛋白抑制剂W13时，W13能明显抑制由Tg激起的Ca2+从钙池中的释放(图1A中下面的一条曲线)。它的半数最大抑制浓度(IC50)约为54 μmol/L。不论W13在Tg刺激细胞前或后加入，从图1A及图1B中，都可以发现W13均能抑制由Tg产生的Ca2+内流及其初始速率(图1中下面的一条曲线)。在Tg之前及之后引起钙内流抑制，其IC50分别为约44和63 μmol/L。在Tg之前及之后，不同浓度的W13对Tg激起的H4-ⅡE细胞钙释放、钙内流及内流速率的影响和抑制情况，如图2所示。
图2 W13抑制浓度曲线图
　　a:W13抑制毒胡萝卜素（Tg）诱导的钙离子从钙池释放； B，C:W13加在Tg前或后的钙内流。图中数据由3～7个单独的实验所得（均数±标准差），实心曲线由目测绘出。
　　W7、calmidazolium与W13一样，同样也能抑制由Tg刺激引起的钙释放和钙内流。W7是W13的类似物。因此，其抑制情况与作用效果与W13相似(附表)。不论在Tg之前或之后加入，它们的抑制效果都是随浓度的升高而增强。只是当W7在Tg之前加入似乎比在Tg之后加入更能抑制由Tg诱导的钙内流(表1)。W7在Tg之后加入，IC50为80 μmol/L。Calmidazolium同W13，W7相比，其抑制效果更强。它的IC50(在Tg之前加入时)仅约为5.2 μmol。与不加calmidazolium的空白对照组相比，calmidazolium不论在Tg之前还是之后加入，均能明显抑制H4-ⅡE细胞的钙内流(P＜0.001，附表)，且亦能抑制钙离子从钙池的释放。不同浓度的calmidazolium对Tg诱导的H4-ⅡE细胞钙离子的释放作用以及在Tg之后加入时，对细胞钙内流的抑制，并不随着浓度的升高而升高(附表)。这种情况同Cao和Chatton在大鼠肝细胞中的实验所得的结果有些相似［5］。
　　3 讨 论
　　3．1 钙调蛋白及其抑制剂的作用机制
　　毒胡萝卜素（Tg）是一种细胞肌浆网或内质网的钙镁离子ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum(Ca2++Mg2+)ATPase，SERCA)的抑制剂，当Tg加入无外源性Ca2+的H4-ⅡE细胞时，由于SERCA受抑制，钙池里的Ca2+浓度降低，细胞质中的Ca2+浓度升高，从而通过一定的机制诱导细胞膜上的RACCs进入细胞质内。由于W13，W7，calmidazolium均能抑制钙调蛋白依赖的磷酸二酯酶(calmodulin-dependent phosphodiesterase)，加入这些药物到细胞中，钙调蛋白的作用就会被抑制。本实验的结果说明了钙调蛋白参与了由Tg激发引起的H4-ⅡE膜上RACCs的打开。钙调蛋白最有可能参与的两个地方是：(1)参与肌醇三磷酸(InsP3)协调的Ca2+从钙池的释放；(2)钙调蛋白与Ca2+结合后直接与细胞膜上的钙通道蛋白作用从而调节膜上钙通道的打开。由于钙调蛋白的功能受到拮抗剂的抑制，同时也影响了依赖钙调蛋白与钙调蛋白结合的许多酶类［8,9］，比如维持细胞骨架完整的一些酶类。因此，当高浓度的calmidazolium(大于5 μmol/L)、W13和W7(均高于100 μmol/L)加入到H4-ⅡE细胞中时，维持细胞骨架的酶类因为钙调蛋白的抑制而受影响，从而出现了细胞形态的改变。象细胞变圆，细胞易于从胶原蛋白包被的圆玻片上剥落，细胞表面出现泡状突起，甚而出现细胞破裂。
　　3．2 H4-ⅡE细胞池操纵钙通道的属性
　　已有研究证实，在大鼠的肝细胞中，钙调蛋白至少参与了由SOCs被激活而引起的Ca2+通道的打开［5］。为了进一步研究钙调蛋白在H4-ⅡE细胞中的作用以及该细胞上RACCs的属性。笔者检测了用EGTA预处理的H4-ⅡE细胞的Ca2+内流情况，由于Tg刺激，使H4-ⅡE细胞在内质网钙池内钙离子降低(释放)时，同时也导致了［Ca2+］C的升高。而用EGTA预处理后，只是细胞内钙池中Ca2+的降低，而并没有引起帮助［Ca2+］C的升高。根据EGTA预处理激起的Ca2+内流结果分析，发现其内流情况与Tg激起的钙内流很相似，而且EGTA预处理引起的H4-ⅡE细胞钙内流还可以被SK&F96365、Gd3+所抑制，Tg激起的该细胞钙内流也能完全被Gd3+(SOCs的一个特性)［10］所抑制(结果另文发表)。由此说明Tg诱导的H4-ⅡE细胞钙内流是通过RACCs中的SOCs(比如通过内质网上钙池内Ca2+的降低而诱导，而非由于细胞质内［Ca2+］C的升高而引起，后者往往可以激发由Ca2+诱导的非选择性离子通道［4］，Ca2+-activated non-selective cation channels)。
　　另外，H4-ⅡE细胞的SOCs与大鼠肝细胞的SOCs属性不同，大鼠肝细胞SOCs的打开与激活，要有G蛋白的参与。G蛋白被认为是在调节肌动蛋白细胞骨架，维持内质网在细胞中正确的空间位置，以及内质网腔间的通信扮演重要的角色。而H4-ⅡE细胞经百日咳毒素(pertussis toxin)或brefeldin A(抑制三体G蛋白作用)处理后，Tg诱导的H4-ⅡE细胞的钙内流并不受明显抑制。因此，没有证据说明G蛋白参与了H4-ⅡE上的SOCs的打开与激活。但是，H4-ⅡE细胞膜上SOCs许多其他属性以及其他类型的RACCs,以及该细胞膜上其他类型的钙通道，比如VOCCs、LGCCs等许多问题有待解决和证实。近几年来，从果蝇(Drosophila)光受体细胞上克隆下来的transient receptor potential(TRP)和Trp-like(Trpl)基因，被认为是研究动物细胞RACCs的最佳选择［11］。因而，H4-ⅡE细胞作为永久细胞系，无疑在研究细胞RACCs，SOCs上有许多优点，如把Trp、Trpl或他们的同系物转导(transfection)到H4-ⅡE细胞中，或在该细胞中转入反义DNA，观察H4-ⅡE细胞钙通道属性的变化，将为进一步了解该细胞膜上有关钙离子通道的结构和机制提供新的结果和证据。
　　（致谢：本研究由国家留学基金委及澳大利亚Flinders大学共同资助下完成，作者在澳洲做访问学者期间受到医学生化系主任Gregory J. Barritt教授悉心指导，在此深表谢意。并感谢该系其他同仁所给予的一切支持和帮助。）
　　作者单位：福建医科大学寄生虫学教研室(福州 350004)
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【求助】关于胰酶消化步骤
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这个帖子发布于6年零341天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请问 这样用胰酶消化细胞比较规范
不知道邀请谁？试试他们
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sinkyyao360 倒掉培养液，加入胰酶，铺满瓶底就好了，不要太多。静止3分钟左右，要快点的话也可以放入培养箱中孵一会，细胞漂起来后，去胰酶。加入含血清的完全培养基吹打这位同学的就不要照着做了。不能消化至漂起来，只要显微镜下看到细胞变圆就可以了，如果都漂起来的话，可能就消化过度而且在弃掉胰酶时细胞全都会随胰酶丢失。一般方法（适用于绝大部分贴壁细胞），以T25cm2为例：1、弃掉原培养基2、加入PBS（如果是原代细胞最好加Hanks液）洗涤3遍3、加入1ml胰酶消化，至细胞变圆4、加入含血清培养基（3－5ml均可以）终止胰酶消化5、吹打成细胞悬液6、将悬液接种至传代的容器中或者弃掉（比例可自行调整）补充说明：消化时间，受室温和细胞贴壁性影响很大。你需要根据你的细胞进行摸索，最先开始消化的时候一定要在显微镜下连续观察，避免消化过度，有的细胞可能1分钟就可以了，有的则需要10分钟。自己看情况掌握吧。以后养的时间长了就明白其中道理了。祝试验顺利！
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1 将培养液倒干净2 我的习惯是加一些PBS轻轻冲洗细胞，后加入胰酶，不需要太多，只要铺满瓶底就可以3 在台子里对着光看到有裂纹就可以加入PBS中和胰酶4 用滴管吹打，将瓶壁细胞吹下来，贴壁紧的就多吹打几下5 将细胞悬液加入离心管内，800转/分，5min6 倒掉上清液，滴加约2ml培养液，吹打均7 将细胞悬液根据实验要求加入细胞瓶中，盖好盖子，标记号，放进孵育箱
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这样是那样？1般我们是，倒干净培养液，加5毫升缓冲液轻涮1下，倒去缓冲液，加胰酶（不含EDTA的可直接加培养液，含EDTA的稍早倒去胰酶，静止2，3分钟加培养液）。
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倒掉培养液，加入胰酶，铺满瓶底就好了，不要太多。静止3分钟左右，要快点的话也可以放入培养箱中孵一会，细胞漂起来后，去胰酶。加入含血清的完全培养基吹打
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胰酶消化细胞比较规范的步骤：1、吸去培养基2、用缓冲液（不含钙镁离子）洗一遍3、加入适当量的胰酶在37度消化3~5min4、将胰酶和细胞的混合液移到15ml离心管1000rpm离心5min，去上清液5、用新鲜的培养基轻微吹匀细胞，传到新的dish中
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补充一点，消化时间不能太长，看到有细胞从瓶壁脱落就可以停止消化了。一般一分半钟就可以了，消化完加入适量培养基，用滴管把细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，吹打同时也有助于细胞的分散。然后转移到离心管中，600rpm，3min足够把细胞收集起来
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1 将培养液倒干净2 我的习惯是加一些PBS轻轻冲洗细胞，后加入胰酶，不需要太多，只要铺满瓶底就可以3 在台子里对着光看到有裂纹就可以加入PBS中和胰酶4 用滴管吹打，将瓶壁细胞吹下来，贴壁紧的就多吹打几下5 将细胞悬液加入离心管内，800转/分，5min6 倒掉上清液，滴加约2ml培养液，吹打均7 将细胞悬液根据实验要求加入细胞瓶中，盖好盖子，标记号，放进孵育箱
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离心不好吧，国外都是直接弃培养液，拍打然后加培养基
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直接弃培养液吗？细胞和培养液是怎么分离的啊？
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1、弃上清液，用PBS洗两遍，弃去PBS。2、25ml小瓶的话加1ml消化液，75ml加3~4ml就够了，晃一晃使消化液均匀的覆盖瓶底3、放入37度培养箱，如果是很好消化的就不用放培养箱里，我之前的单核细胞贴壁很牢，我放培养箱里4min左右就ok了4、取出后拍拍瓶底，用吸管再吹打几下，吸出离心就好了
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1、倒去培养基2、胰酶漂洗，倒尽3、加入适当量的胰酶进行消化4、消化完毕将胰酶和细胞的混合液移到15ml离心管1000rpm离心5min，去上清液5、用新鲜的培养基轻微吹匀细胞，传到新的培养瓶中
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sinkyyao360 倒掉培养液，加入胰酶，铺满瓶底就好了，不要太多。静止3分钟左右，要快点的话也可以放入培养箱中孵一会，细胞漂起来后，去胰酶。加入含血清的完全培养基吹打这位同学的就不要照着做了。不能消化至漂起来，只要显微镜下看到细胞变圆就可以了，如果都漂起来的话，可能就消化过度而且在弃掉胰酶时细胞全都会随胰酶丢失。一般方法（适用于绝大部分贴壁细胞），以T25cm2为例：1、弃掉原培养基2、加入PBS（如果是原代细胞最好加Hanks液）洗涤3遍3、加入1ml胰酶消化，至细胞变圆4、加入含血清培养基（3－5ml均可以）终止胰酶消化5、吹打成细胞悬液6、将悬液接种至传代的容器中或者弃掉（比例可自行调整）补充说明：消化时间，受室温和细胞贴壁性影响很大。你需要根据你的细胞进行摸索，最先开始消化的时候一定要在显微镜下连续观察，避免消化过度，有的细胞可能1分钟就可以了，有的则需要10分钟。自己看情况掌握吧。以后养的时间长了就明白其中道理了。祝试验顺利！
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如果要离心不是就是做细胞传代了吗？？如果紧紧是为了让细胞脱壁我们都是先出去培养液
然后用2mlpbs冲洗两遍
再加等量的pbs和胰酶
然后放入5%co2
37℃的培养箱培养一会 大约1分钟
但是不是绝对的得去显微镜下观察细胞的脱壁情况才能定消化的时间
但是不能很久 因为胰酶对细胞的损伤很大的
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