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基因敲除敲入CRISPR/Cas9流程
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CRISPR流程：
一、利用Cas9 质粒建立knock-out 细胞系实验的详细过程
1.1 确定待敲除基因的靶位点
1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）
1.3 构建表达sgRNA的质粒
1.4 sgRNA活性检测
1.5 利用Cas9 质粒建立knock-out 细胞系
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做细胞敲除，你呢，加（基因底层代码）共同进步
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非常好，谢谢
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　　6月17日，由生物谷主办的“2016（第三届）基因编辑研讨会”在沪隆重召开。南京医科大学特聘教授戴一凡为我们带来了关于“利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立基因改造猪”的精彩报告。
　　戴一凡博士现为南京医科大学特聘教授，江苏省异种移植重点实验室主任。戴一凡教授主要从事转基因大动物和异种移植方面的研究，建立基因改造的克隆猪作为异种移植的供体，以求解决目前供体严重不足的现状，研究成果先后于2002年和2006年两次进入美国《Discover》杂志全球前100位重大科学新闻。曾获器官移植领域的Fujisawa年轻科学家奖。
　　本次会议中，戴一凡教授首先提到CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用大大促进了建立基因改造猪的速度和效率。十几年前，戴一凡教授带领的团队曾利用传统的同源重组基因打靶技术建立了国际上第一批aGal敲除猪，大大促进了异种移植领域的进展。这一研究成果花费了2年多的时间和大量的人力物力。而目前利用CRISPR/Cas9基因编辑技术只需要短短6个月时间就能获得纯合的多基因改造猪。
　　随后，戴一凡教授结合他们实验室的具体研究为我们讲解了CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因改造猪上的应用。首先，最新研究报道利用CRISPR/Cas9同时敲除三个关键猪糖分子基因（GGTA1/CMAH/β4GalNT2 genes），可消除超级性排斥反应。戴教授实验室目前也在重复这个最新的研究成果，且计划利用这种三基因敲除产生心脏瓣膜。其次，利用CRISPR/Cas9可以一次性去除猪内源性病毒，这项工作是由哈佛医学院George Church实验室2015年底发表在Science杂志上。
　　接下来，戴一凡教授提出利用种间囊胚互补产在猪上产生人的器官，从而实现异种移植所需要的三个条件。第一，需要找到对于猪的器官或者细胞发育的关键基因，并在猪上进行敲除。第二，需要找到合适的培养naive状态的灵长类胚胎干细胞或者诱导多能干细胞的条件，因为用naive状态下的干细胞才能实现很好地分化。第三，伦理问题。
　　随后，戴教授结合这三个问题以及已有研究进展和他们实验室的研究情况进行了深入讲解。对于第一个条件，戴教授拓展道，目前已知的关键基因比如Pxd-1对于猪胰腺的发育至关重要，IgM对于猪B淋巴细胞的形成不可或缺。并且对于眼睛，心脏和肺发育的关键基因也已经找到。戴教授也希望通过这些关键基因实现马的诱导多能干细胞在猪中长成马的肺，相关工作正在推进。对于第二个条件，戴教授提到了最新同行还未正式发表，但已有新闻报道的“科学家使‘人猪合体’胚胎可存活28天”的工作。对于第三个条件，戴教授讲解了一些可能的解决办法，比如通过导入中枢神经系统或生殖系统特异的致死基因到人的干细胞中，这样，干细胞就不会在猪的脑子或者生殖系统中发育，形成人们最担心的整合到猪的神经或者生殖系统的情况。或者通过修饰人的干细胞，使它们只能发育成特定的组织或器官。
　　最后，戴教授简单介绍了关于利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立基因敲除猪疾病模型的工作。
　　精彩还在继续，关注生物谷平台及官方微博@生物谷跟进会议最新动态！（生物谷 ）
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客服邮箱：“基因敲除狗”，“基因敲除猪”，CRISPR/Cas9到底是怎样一个技术
来源：科普中国
近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。（可参阅医谷此前发布的《》一文）科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗？杜德娜和艾曼纽？夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。二、CRISPR/Cas系统的灵感来源CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的。在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（Clustered&Regularly&Interspersed&Short&Palindromic&Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。1、“记录”入侵者档案其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。（如图A所示）。图1&CRISPR序列示意图其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（Protospacer&adjacent&motifs-原间隔序列临近基序）。当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。2、打击二次入侵者当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR&RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。三、CRISPR/Cas9技术的实现需要什么？在CRISPR/Cas9技术中，我们把即将被编辑的细胞基因组DNA看作病毒或外源DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导RNA（guide&RNA，&gRNA）和Cas9蛋白。其中，向导RNA的设计并不是随机的，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（即三碱基序列NGG，其中N可以是任意碱基），而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例，如图3所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。图2&CRISPR/Cas9技术敲除掉部分基因原理图而DNA片断的插入或定点突变的实现，只需在此基础上为细胞提供一个修复的模板质粒，这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变，对受精卵细胞进行基因编辑，并将其导入代孕母体中，可以实现基因编辑动物模型的构建。图3&CRISPR/Cas9技术插入新基因原理图当然，CRISPR/Cas9技术的成功率并非百分之百。向导RNA靶向序列的非特异性，以及DNA损伤修复的不确定性，都可能会导致基因组上其它位置产生未知的突变，也就是所谓的“脱靶”现象，这也是现阶段影响CRISPR/Cas9技术应用的瓶颈之一。但随着科研人员不断对Cas9蛋白的优化改造，对靶基因识别特异性的增强，&CRISPR/Cas9技术的“打靶”效率将不断提高。四、CRISPR/Cas9的前景如何？CRISPR/Cas9技术在医疗健康、生产生活、家畜育种等领域的应用，不断取得喜人的新成果。如在医疗健康领域，用iPS细胞（诱导多能干细胞）治疗人类的镰刀形贫血症，可以将病人的皮肤细胞诱导成iPS细胞，利用CRISPR/Cas9技术介导同源重组来修复发生突变的血红蛋白基因，再将修复的iPS细胞定向诱导分化为造血干细胞移植到病人体内。此外，像使用CRISPR技术根除HIV病毒、诱导宫颈癌细胞自我毁灭、构建癌症模型等最新成果先后被Nature等着名杂志所报道。在奶制品的发酵中，利用CRISPR/Cas9增强发酵菌株对噬菌体的防御能力；在家畜育种方面，也正在利用基因编辑工具通过对显着影响家畜生产性能的基因位点进行改良，以实现猪、牛、羊等大型家畜生产性能的提高等。但正如科学是把双刃剑，任何新技术的出现都少不了其反对者的存在，在CRISPR/Cas9技术得到热烈呼声的同时，不少人也对它提出了质疑，特别是对其脱靶事件可能导致基因组其他位置产生未知突变表示担忧。作为生命科学领域的一项重大突破，笔者认为CRISPR/Cas9的创新性、技术性毋庸置疑，随着对CRISPR系统认识的加深，实验设计的优化改造，相信其打靶效率会进一步提高，CRISPR/Cas9以及其衍生技术终究会带来一场科学史上的巨大变革。期待在不久的将来，CRISPR/Cas9所带来的巨大转变必将能够惠泽万家，到时候属于它的诺奖终将到来。参考文献：[1]Doudna，&J.A。；&Charpentier，&E。，&Genome&editing。&The&new&frontier&of&genome&engineering&with&CRISPR-Cas9。&Science，&2014，&346，&（6213），&1258096。[2]&Fang，&R。；&Chang，&F。；&Sun，&Z。-L。；&Li，&N。；&Meng，&Q。-Y。，&New&Method&of&Genome&Editing&Derived&From&CRISPR/Cas9。&Acta&Agronomica&Sinica，&2013，&40，&（8），&691。医谷链《》
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CAS9/CRISPR基因敲除实验交流
CAS9/CRISPR 基因敲除实验自问世以来发展非常迅速，在2013年被评为Science，Nature的十大科技进展。
有兴趣或者有需要的请看下面一些链接：
http://www.addgene.org/CRISPR/
Addgene上的介绍
/blog-581.html
科学网科普文章
/nprot/journal/v8/n11/full/nprot..html
Zhang Feng Lab最新文章
我们实验室成功的建立了该实验系统，能在14-30天内筛选到稳定敲除某基因的细胞系，可应用于多种细胞系的基因敲除（如293T，Hela，A549等）。但是在其他细胞中的效率还不高，希望和大家多多交流，共同提高。
我们可以做的是：
293T，Hela，A549细胞中CAS9/CRISPR 的SgRNA的设计，SgRNA载体构建，稳转细胞系构建和鉴定；如果大家有需求，我们可以为大家交换载体，免费设计。
我们的目的：
1，& & & & 和同行们多多交流，共同进步；
2，& & & & 和大家多多合作，为我们的科技进步共同贡献一份力。
我的QQ是：，BioDoctor
最后祝大家实验顺利，万事如意！
这么说没根据吧！我们正在用，这两年应用这个技术的肯定会越来越多。
这个必须有了，在CAS9在小麦wheat和水稻rice里早都能用了
嗯，是的，不过大部分都在可以接受的范围，放心使用吧，当然用DN会更好些
我们做过烟草和水稻的
你好，方便交流下吗，我也在做，:hand:
烟草的可以直接用农杆菌侵染吗，敲除率高不高？:arm:
您好，有相关的载体吗，我做转基因的，很需要啊
可以啊，请联系 ，我们也能提供一些技术服务。顺祝实验顺利，谢谢。
一起比较常规，主要还是分子及细胞的常用技术，及载体资源等，我们可以提供一些技术服务，请联系 QQ。顺祝实验顺利，谢谢。
可以交流啊，请联系。
The GR8 (芽孢杆菌) genome contained only one restriction-modification system and no CRISPR/Cas system
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
我们也要做大肠杆菌的敲出，怎么出的问题呢？交流一下，我也是新手。问一下，这个引物是怎么构建的？
那是你最新文献读得太少了。现在有些以前用RNAi的实验都改用crispr了
是的，这个技术在2015年国家自然科学基金申请书中出现的频率也很高，说明国内也再更多的使用这个新技术。
现在我们已经更新了设计SgRNA的原则，更方便检测，比T7E1更快，更有效的鉴定；敲除效率也更高。
需要我们的技术服务的话请联系 ＱＱ：
加你QQ了，请问在蓝藻（铜绿微囊藻）中能使用吗？ 想敲除其中一个基础代谢的基因
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
RNA Biol. ):687-93. doi: 10.4161/rna.24571. Epub 2013 Apr 11.
Evidence for the widespread distribution of CRISPR-Cas system in the Phylum Cyanobacteria.
Cai F1, Axen SD, Kerfeld CA.
这个也是比较早就有了。
CRISPR被报道后发展迅速，在人类细胞、小鼠、斑马鱼、酵母、细菌、果蝇、线虫、拟南芥等物种中都可以用。
可以说没有做不到，只有想不到！
以后会越来越广泛及便捷的使用，快来试试吧。
请问你在细菌里做成功了吗？，可不可以交流一下，我刚做很多不懂，想请教一下
我是在酵母上做的，可以交流一下吗？我的QQ
我想请教下 你们是做植物还是动物呀
我们是做酵母的 才刚刚开始
可以加我QQ交流一下吗
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: 418-421&&&&DOI:
Laboratory Technique
Crispr/Cas9 技术在CHO 细胞中基因敲除的应用
上海交通大学药学院，细胞工程及抗体药物教育部工程研究中心，上海 200240
Applications of Crispr/Cas9 in Gene Disruption of CHO Cells
School of Pharmacy, Shanghai Jiaotong University, Engineering Research Center of Cell and Therapeutic Antibody,&Ministry of Education, Shanghai 200240
摘要&Crispr/Cas9 技术是近年发展起来的基因编辑技术，已经在人、动物、植物等各类细胞中得到广泛应用。本文基于文献和本实验室研究成果，介绍了Crispr/Cas9 技术在CHO 细胞中运用的基本操作方法，以及与重组蛋白表达相关的基因敲除实例，对可能遇到的问题做出了技术解释。笔者认为可利用Crispr/Cas9 技术对CHO 细胞进行改造以创造出新的工程细胞株，为生物药物开发及生产服务。
<INPUT type=hidden value="我在《中国医药工业杂志》上发现了关于“Crispr/Cas9 技术|CHO 细胞|向导RNA|生物药物研发”几篇好文章，特向您推荐。请点击下面的网址：" name=neirong>
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关键词： &&
Abstract：
Crispr/Cas9 is a newly developed gene editing technology. It has been widely applied to gene&manipulation in various species such as human, animal, plant cells, etc. Based on recent publications and the researches in&our laboratory, we provide a basic experimental protocol for conducting Crispr/Cas9 in CHO cells. We also give examples&on disruption of genes associated with protein expression in CHO cells and explanations on some issues that researchers
might encounter during implementation of this protocol. It is concluded that this novel gene editing tool is applicable in&engineering of CHO cells to create an ideal host for biopharmaceuticals development and production.
Key words：
通讯作者: 朱建伟(1956-)，男，教授，博士生导师，从事生物技术制药研究与开发。
E-mail：jianweiz@&&&
作者简介: 孙 涛(1991-)，男，硕士研究生，专业方向：微生物与生化药学。
引用本文: &&
. Crispr/Cas9 技术在CHO 细胞中基因敲除的应用[J]. 中国医药工业杂志, ): 418-421.
. Applications of Crispr/Cas9 in Gene Disruption of CHO Cells[J]. CJPH, ): 418-421.
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