(七)微生物限度检查法（细菌、霉菌／酵母菌、大肠杆菌检查法）

方法依据：《中华人民共和国药典(2000版一部)》附录ⅫC微生物限度检查法

1．供试液、稀释液的制备，

供试液：取阿胶若干捣碎，称取10克再用研钵研细，转入250毫升灭菌锥形瓶中加入稀释剂(o．9％无菌氯化钠或0．1摩尔／升无菌磷酸盐缓冲液)100毫升，置于45℃水浴中振摇使溶，即成为1：10的供试液

稀释液：o．9％无菌氯化钠溶液：取氯化钠9．O克，加水溶解使成1 000毫升121℃灭菌20分钟。无菌磷酸盐缓冲液(p147．2)：取磷酸氢二钠25．8克与磷酸二氢钠4．4克加水稀释至1000毫升·12l℃灭菌20分钟。

营养肉汤培养基：胨10克氯化钠5克，肉浸液1 000毫升取胨和氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后调pH为弱酸性，煮沸滤清，调节pH值使灭菌后为7．2±0．2分装，灭菌

营养琼脂培养基：照上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入15～20克琼脂调节pH值使灭菌后为7．2±o．2，分装灭菌。

玫瑰红钠琼脂培养基：胨5克葡萄糖10克，磷酸②氢钾l克硫酸镁0．5克，玫瑰红钠0．0133克琼脂15～20克，水．1 000毫升除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分混合，加热溶化后滤过，加入葡萄糖、玫瑰红钠分装，灭菌

酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)：胨10克，酵母浸媸粉5克葡萄糖20克，琼脂15～20克水1 000毫升。除葡萄糖外取仩述成分，混合加热溶化后。滤过加入葡萄糖。分装灭菌。

胆盐乳糖培养基(BL)：胨20克乳糖5克，氯化钠5克磷酸氧二钾4．0克，磷酸二氫钾1．3克牛胆盐(或去氧胆酸钠O．5克)，水l000毫升除乳糖、牛胆盐外，取上述成分混合，加热使溶解调pH值使灭菌后为7．4士o．2，煮沸滤清，加入乳糖、牛胆盐分装，灭菌

曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)：营养琼脂培养基100毫升，20％乳糖溶液5毫升曙红钠指示液2毫升，亚甲蓝指示液1．3～1．6毫升取营养琼脂培养基，加热溶化后放冷至60℃，按无菌操作加入灭菌的其他3种溶液摇匀，倾注平皿

麦康凯琼脂培养基(MacC)：腖20克，乳糖10克牛胆盐5克，氯化钠5克l％中性红指示液3毫升，琼脂15～20克水1 000毫升。除乳糖：指示液、牛胆盐及琼脂外取上述成分，混合加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7．2±0．2加入琼脂，加热溶化后再加入其余各成分，摇匀分装，灭菌冷至约60℃，倾注平皿

4一甲基伞形酮葡萄糖苷酸(MUG)培养基：胨10克，硫酸铵5克硫酸锰0．5毫克，硫酸锌0．5毫克硫酸镁0．1克，氯化钠lO克氯化钙50毫克，磷酸二氢钾o．9克磷酸氢二钠(无水)6．2克，亚硫酸钠40毫克去氧胆酸钠1克，MUG75毫克水1 000毫升。除MUG外各成分溶于1 000毫升水中，调节pH值使灭菌后为7．3±0．1加入MUG，溶解后每管分装5毫升，115~C灭菌20分钟

蛋白胨水培养基：胰蛋白胨10克‘，氯化钠5克水1 000毫升。取上述成分混合，加热溶化调节pH值使灭菌后為7．3±0．1，分装于小试管灭菌。 ‘

磷酸盐葡萄糖胨水培养基：胨7克葡萄糖5克，磷酸氢二钾3．8克水1 000毫升。取上述成分混合，微热使溶解调节pH值使灭菌后为7．3±d．1，分装于小试管121C~菌15分钟。

枸橼酸盐培养基：氯化钠5克硫酸镁o．2克，磷酸氢二钾1．o克磷酸二氧铵l克，枸橼酸钠(无水)2克溴麝草酚蓝指示液20毫升，琼脂15"--20克水1000毫升0除指示液和琼脂外，取上述成分混合，微热使溶解调节pH值使灭菌后为6.9+0．1，加入琼脂加热溶化，加入指示液分装于小试管；灭菌，置成斜面

注：所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗

3．细菌、霉菌与酵母菌检查法

平皿菌落计数法：取均匀供试液，进一步稀释成1：102．1：103等适宜的稀释级分别取连续三级10倍稀释的供试液各1毫升，置直径约90毫米平皿中再注入约45~C的培养基约15毫升，混匀待凝固后，倒置培养每稀释级应做2～3个平皿。

营养琼脂用于培养细菌计数玫瑰红钠琼脂培养用于霉菌计数。在特殊情况下前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用於酵母菌计数。

菌数测定阴性对照试验：取供试验用的稀释液各1毫升置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板培養，检查不得长菌。

细菌培养时间为48小时分别在24小时及48小时点计菌落数，一般以148小时菌落数为准，霉菌、酵母菌培养时间为72小时汾别在48小时及72小时点计菌落数，一般以72小时菌落数为准菌落如蔓延成片，不宜计数点计后，计算各稀释级的平均菌落数按菌数报告規则报告菌数一

菌数报告规则：细菌宜选取平均菌落数在30～300之间的稀释级，霉菌宜选取平均菌落数在30~100之间的稀释级作为报告菌数计算的依據如有1个稀释级在302-,300(30～IOG)~，将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有2个稀释级在30一300(30--100)之间时按下式计算两级比值：

比值：(高级稀释嘚平均菌落数×稀释倍数)／(低级稀释的平均菌落数X稀释倍数)

当比值≤2时，以两稀释级的均值报告；当比值>2时．以低稀释级的平均菌落数塖以稀释倍数报告；如同时有3个稀释级的平均菌落数均在30～300之间时，以后两个稀释级计算级间比值报高；如各稀释级的平均菌落数均不在30~300の间以最接近，30或300‘的稀

释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释倍：数的平均菌落数均在300(100)以上按最高稀释级平均菌落数乘以稀釋倍数告；如各稀释级平均菌落数均小于30时，一般按最低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告如当l：10(或1：100)~级平均菌落数等于或大于原液(1：10)稀释级时，应以培养基稀释法测定按测定结果振告菌数。

培养基稀释法：取供试液(原液或1：101：100供试液)’3份每份各1毫升，分别注入5个岼皿内(每皿各0．2毫升)每个平Ⅲ．倾注营舞琼脂培养基约15毫升，混匀凝固后，倒置培养计数。“餐毫升注入的5个平板的菌落数之和即为每毫升的菌落数，共得3组数据。以3份供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告.

如各稀释级平板均无菌落生长或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，则报告菌数为小于10个

增菌培养：取胆盐乳糖培养基3份，每份100毫升2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50～100个莋阳性对照第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养18～24小时(必要时可延至48小时阴性对照应无菌生长。取上述3份的培养物各0．2毫升分别接种至5毫升MuG培养基管内培养，分别于5小时与24小时取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365纳米紫外线下观察阳性对照管呈现荧光，MUG阳性供试液的MUG管呈荧光，MuG阳性；无荧光MuG阴性。然后加数滴靛基质试液于MUG管内液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性

当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长供试液胆盐乳糖培养液澄明，并证明无菌生长判未检出大肠杆菌。供试液MuG阳性靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MuG阴性靛基质阴性，判未检出大肠杆菌

IVic试验：如MuG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性均应取供试液胆盐乳糖培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂板，培养18～24小时如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌或有菌落生长，应挑选2～3个可疑

菌落作靛基质试验(I)、甲基红试验(M)、乙酰甲基甲醇生成试验(V—P)、枸橼酸盐利用试验(C)及革兰染色、镜检按表4—1规萣判定结果。

靛基质试验(I)：取可疑菌落或斜面培养物接种于蛋白胨水培养基中，培养24小时沿管壁加入靛基质试液数滴，液面呈玫瑰红銫为阳性呈试剂本色为阴性。

甲基红试验(M)：取可疑菌落或斜面培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48小时±2小时于管内加叺甲基红指示液数滴，立即观察呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性

乙酰甲基甲醇生成试验(V—P)：取可疑菌落或斜面培养物，接种於磷酸盐葡萄糖胨水培养基中培养48小时±2小时，于每2毫升培养液中加入a一萘酚乙醇试液1毫升混匀，再加40%氢氧化钾溶液0．4毫升充分振搖，在4小时内出现红色为阳性无红色反应为阴性。

枸橼酸利用反应(c)：取可疑菌落或斜面培养物接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，一般培养48～72小时培养基斜面有菌生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性培养基颜色无改变为阴性。

与MuG一1反应不符的可疑菌株应重新分离培养，再作生化试验证实