Duchefa产品详细列表（可链接到配方表）
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　　MS（Murashige & Skoog）培养基是目前普遍使用的培养基，它有较高的无机盐浓度，能保证组织生长所需的矿质营养，对愈伤组织的生长十分有利。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不致影响培养基离子间的平衡。MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养，它的液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显成功。
在MS培养基的基础上研究者们根据实验的需要又陆续研发了各种各样的培养基，以下列举几种常用培养基的特点：
B5培养基，含较低的铵，双子叶植物尤其木本植物组织培养可选择。
N6培养基，成分简单，KNO3和(NH4)2SO4含量高，广泛应用于小麦、水稻及其它植物的花药培养等。
WPM/木本植物培养基，使用K2SO4替换了KNO3，NH4NO3的含量也降至MS培养基的1/4，最初是为山月桂茎尖培养设计的，目前主要用于木本植物的组织培养。
Nitsch培养基，适合于花药培养和愈伤组织培养等。
Duchefa公司除了提供植物细胞和组织培养基外，还生产各种植物生长调节剂、抗生素、植物胶凝、酶作用底物、植物分子生物化学试剂等，种类超过400种，广泛地用于植物生物技术开发以及植物病理学研究。
北京启维益成公司授权代理荷兰Duchefa公司系列培养基，在此提供常用培养基的详细配方表以方便广大用户查询。如需了解更多其他培养基成分详情，可致电400-810-0506进行咨询，也可根据您的具体要求进行定制。
Duchefa产品详细列表
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Murashige & Skoog medium
MS基本培养基(不含维生素)（常备现货）
Murashige & Skoog medium including vitamins
MS基本培养基(含维生素)（常备现货）
Macro salt mixture MS
MS大量元素（常备现货）
Micro salt mixture MS
MS微量元素
Murashige & Skoog medium mod.No. 1A
改良MS基盐（1/2大量元素）
Murashige & Skoog medium mod.No. 1B
改良MS培养基（含1/2大量元素）（常备现货）
Murashige & Skoog medium mod.No. 2A
改良MS基盐（含3/4大量元素）
Murashige & Skoog medium mod.No. 2B
改良MS培养基（含3/4大量元素）
Murashige & Skoog medium vitamin mixture
MS维生素混合物 1000×（常备现货）
Murashige & Skoog medium mod.No. 5
改良MS基盐（NaNO3替代NH4NO3）
Murashige & Skoog medium mod.No. 4
改良MS基盐（不含NH4NO3）（常备现货）
Murashige & Skoog medium mod.No. 3A
改良MS基盐（含1/2NH4NO3和KNO3）（常备现货）
Murashige & Skoog medium mod.No. 3B
改良MS培养基（含1/2NH4NO3和KNO3）
Murashige & Skoog medium including B5 vitamins
MS基盐含B5维生素（常备现货）
Murashige & Skoog med.Finer&Nagasawa
改良MS基盐（1.6×KNO3 & 0.5×NH4NO3）
Murashige & Skoog med.van der Salm
改良MS基盐（van der Salm改良）
Murashige & Skoog med.van der Salm / vitamins
改良MS培养基(van der Salm改良)
Murashige & Skoog medium incl. MES buffer
MS基盐(含MES 缓冲液)（常备现货）
Gamborg B5 medium including vitamins
B5培养基（含维生素）（常备现货）
Gamborg B5 medium
B5培养基基盐（不含维生素）（常备现货）
Gamborg B5 vitamin mixture
B5维生素混合物 1000×（常备现货）
CHU (N6) medium including vitamins
N6培养基含维生素（常备现货）
CHU (N6) medium
N6培养基基盐（常备现货）
CHU vitamin mixture
N6维生素混合物（常备现货）
NB basal medium
N6培养基大量元素和B5培养基的微量元素和维生素混合物
McCown Woody Plant medium
WPM/木本植物培养基基盐（常备现货）
McCown Woody Plant medium including vitamins
WPM/木本植物培养基含维生素（常备现货）
McCown Woody Plant vitamin mixture
木本植物培养基混合物 1000×
其他培养基
<FONT color=#01.0050
Anderson’s Rhododendron
Anderson’s 培养基基盐
<FONT color=#02.0050
Anderson's Rhododendron including vitamins
Anderson's培养基含维生素
<FONT color=#48.0010
CH&EE & POOL medium
CH&EE & POOL 培养基基盐
CH&EE & POOL medium including vitamins
CH&EE & POOL培养基含维生素
<FONT color=#28.0050
CLC / Ipomoea CP medium
CLC /（番薯属植物）CP培养基
<FONT color=#29.0050
CLC / Ipomoea EP medium
CLC /（番薯属植物）EP培养基
<FONT color=#05.0050
De Greef & Jacobs medium
De Greef & Jacobs 培养基基盐
<FONT color=#06.0050
De Greef & Jacobs medium including vitamins
De Greef & Jacobs 培养基含维生素
DKW/Juglans medium
DKW/胡桃 培养基基盐
<FONT color=#47.0050
DKW/Juglans medium including vitamins
DKW/胡桃 培养基含维生素
<FONT color=#07.0050
Eriksson (ER) medium
Eriksson (ER) 培养基基盐
Eriksson (ER) medium including vitamins
Eriksson (ER)培养基含维生素
<FONT color=#11.0050
Gresshoff & Doy medium
Gresshoff & Doy 培养基基盐
<FONT color=#12.0050
Gresshoff & Doy medium including vitamins
Gresshoff & Doy 培养基含维生素
<FONT color=#13.0025
Heller medium
Heller 培养基基盐
<FONT color=#14.0010
KAO & Michayluk medium
KAO & Michayluk 培养基基盐
Knudson C Orchid medium
Knudson C兰科植物培养基基盐
Lindemann Orchid medium
Lindemann 兰科植物培养基基盐
Linsmaier & Skoog medium
Litvay medium
Litvay 培养基基盐
Litvay medium including vitamins
Litvay 培养基含维生素
Nitsch medium
Nitsch 培养基基盐
Nitsch medium including vitamins
Nitsch培养基含维生素
NLN medium
NLN培养基基盐
NLN medium vitamin mixture
NLN 培养基维生素混合物 常备现货
Orchimax including activated charcoal
Orchimax 培养基含活性炭和MES
Orchimax without activated charcoal
Orchimax 培养基含MES不含活性炭
Quoirin & Lepoivre medium
Quoirin & Lepoivre培养基基盐（李属植物幼苗培养基基盐）
Quoirin & Lepoivre medium including vitamins
Quoirin & Lepoivre培养基含维生素（李属植物幼苗培养基）
Rugini Olive Medium
Rugini 培养基（橄榄树幼苗）
Schenk & Hildebrandt medium
Schenk & Hildebrandt 培养基（双子叶和单子叶植物悬浮细胞）
Vacin & Went medium
Vacin & Went 培养基基盐
Westvaco WV5 medium incl. vitamins
Westvaco WV5 培养基含维生素（火炬松胚性组织发生）
White medium
White 培养基基盐
维生素混合物
McCown Woody Plant vitamin mixture
木本植物维生素混合物
Murashige & Skoog medium vitamin mixture
MS维生素混合物 常备现货
CHU vitamine mixture
N6维生素混合物 常备现货
DKW/Juglans vitamin mixture
DKW维生素混合物
Eriksson (ER) vitamin mixture
Eriksson (ER) 维生素混合物
Gamborg B5 vitamin mixture
B5维生素混合物
Gresshof & Doy (DBM2) vitamin mixture
Gresshof & Doy (DBM2) 维生素混合物
Linsmaier & Skoog vitamin mixture
Linsmaier & Skoog (LS)维生素混合物
Litvay vitamin mixture
Litvay 维生素混合物
Nitsch vitamin mixture
Nitsch 维生素混合物
Schenk&Hildebrandt vitamin mixture
Schenk&Hildebrandt 维生素混合物
大量元素/微量元素混合物
Macro salt mixture B5
B5 大量元素混合物
Macro salt mixture MS
MS 大量元素混合物 常备现货
Macro salt mixture Nitsch
Nitsch 大量元素混合物
Micro salt mixture B5
B5 微量元素混合物
Micro salt mixture MS
MS 微量元素混合物
Micro salt mixture Nitsch
Nitsch 微量元素混合物
抗生素/筛选剂
5-fluoro orotic acid (5-foa)&
5-氟乳清酸
5-fluorouracil (5-fu)&&
5-氟尿嘧啶
6-mercaptopurine monohydrate&&
6-巯(基)嘌呤一水合物
8-hydroxyquinoline&&&
8-羟基喹啉
Acyclovir&
Amiprophos methyl&
甲基氨草磷
Amoxycillin sodium / clavulanate potassium
阿莫西林钠/克拉维酸钾
Amoxycillin trihydrate&
阿莫西林三水合物
Amphotericin B
Amphotericin B suspension
两性霉素B悬液
Ampicillin sodium
氨苄西林钠盐
Apramycin sulphate
硫酸阿布拉霉素
阿特拉津/莠去津
Bacitracin
Carbenicillin disodium
羧苄青霉素钠盐
Cefotaxime sodium
头孢噻肟钠盐
Cephalexin monohydrate
头孢氨苄一水合物
Chloramphenicol
Chlorhexidine digluconate
葡萄糖酸氯己定/洗必泰
Chloroxylenol ("dettol")
对氯间二苯酚
Chlortetracycline HCl
金霉素盐酸盐
Clindamycin HCl
盐酸克林霉素
Colistin sulphate
硫酸粘菌素
Cycloheximide
放线菌酮 (环已酰亚胺)
D-Cycloserine
D-环丝氨酸
Doxorubicin HCl 0.2% in 0.9% NaCl solution (5ml)
盐酸阿霉素
Doxycycline HCl
盐酸多西环素
Erythromycin
G-418 Disulphate
G418 二硫酸盐
Gentamycin sulphate
硫酸庆大霉素
Glyphosate
Griseofulvin
Hygromycine B& per Vial / solution
Kanamycine sulphate monohydrate
一水合硫酸卡那霉素
Methotrexate
Metronidazole
Miconazole nitrate
硝酸咪康唑
Minocycline HCl
米诺环素盐酸盐
Mitomycin C
丝裂霉素 C
Nalidixic acid
Neomycin sulphate
硫酸新霉素
Paromomycin sulphate
硫酸巴龙霉素
Penicillin G sodium
青霉素 G钠盐
Phleomycin
Phosphinotricin
草丁膦/草胺膦
Polymixine B sulphate
硫酸多粘菌素B盐
三氮唑核苷
Rifampicin
利福平 常备现货
Spectinomycin HCl pentahydrate
盐酸壮观霉素五水合物
Sterillium
Streptomycin sulphate
硫酸链霉素
Sulphamethoxazole
磺胺甲恶唑
Tetracycline HCl
盐酸四环素
Thimerosal
Ticarcillin disodium
替卡西林二钠盐
Ticarcillin disodium /& clavulanate potassium
替卡西林二钠盐/克拉维酸钾盐
Tobramycine sulphate
硫酸妥布霉素
Trimethoprim
甲氧苄胺嘧啶
Validamycin A
Vancomycin
2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid
2,4,5-三氯苯氧基乙酸
2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4 D)
Indole-3-acetic acid (IAA)
IAA& 常备现货
Indole-3-butyric acid (IBA)
IBA &常备现货
p-Chlorophenoxyacetic acid (4-CPA)
对氯苯氧乙酸（4-CPA）
α-naphtalene acetic acid
β-Naphtoxyacetic acid
β-萘氧乙酸
细胞分裂素类
Dimethylallylamino purine (2-iP)
4-CPPU/吡效隆醇
6-(Y-Y-Dimethylallylamino) purine (2-IP) riboside
N6-异戊烯基腺嘌呤核苷
6-Benzylaminopurine (6-BAP)
6-BAP/6-BA
6-Benzylaminopurine riboside
6-苄基腺苷
Adenine hemisulphate anhydrous&&&&&
无水腺嘌呤硫酸盐
Dihydrozeatin (DHZ)
二氢玉米素
激动素& 常备现货
Meta-topoline
N-benzyl-9-(tetrahydropyranyl)-adenine (BPA)
苄吡喃腺嘌呤
Thidiazuron
TDZ/噻苯隆 &常备现货
反式玉米素
Zeatin Riboside
反式玉米素核苷
赤霉素合成抑制剂
Flurprimidol
呋嘧醇/调嘧醇
Paclobutrazol
Gibberellic acid 4+7
Gibberellic acid A3
其它植物生长调节剂
2,3,5-Triiodobenzoic acid
2,3,5-三碘苯甲酸
Absisic Acid (S-ABA)
氟草酮/氟啶酮
Jasmonic acid
Maleic hydrazide
Methyl jasmonate
茉莉酸甲酯
Naphthylphtalamic acid
NPA 常备现货
Putrescine HCl
Daishin agar
Micro agar
植物组培和微生物用琼脂粉
Phyto agar
植物组织培养用琼脂粉
Plant agar
植物细胞和组织培养用琼脂粉 常备现货
Agarose SPI
核酸电泳用琼脂糖
Low melting Agarose PPC
低熔点琼脂糖
Seaplaque&#8482; Agarose
克隆细胞系用琼脂糖
Carrageenan Iota Type
Gelcarin GP- 812
Gelrite&#8482;& 常备现货
Cellulase R-10
纤维素酶 R-10
Cellulase RS
纤维素酶 RS
Macerozyme R-10
离析酶 R-10
Pectolyase Y-23
果胶酶 Y-23
植物病理和微生物培养基
Bacteria Screening Medium 523
细菌筛选培养基
CKTM Medium
CKTM 培养基
Czapek Dox Agar, CDA
CDA 培养基
Czapek Dox Broth, CDB
CDB 培养基
D2ANX Medium
D2ANX 培养基
KB medium (King's B Medium)
KBBC Medium
KBBC 培养基
KBZ Medium
KBZ 培养基
LB Agar High salt
LB 琼脂高盐培养基
LB Agar Low salt
LB 琼脂低盐培养基
LB Broth High salt
LB肉汤高盐培养基
LB Broth Low salt
LB肉汤低盐培养基
Leifert & waites sterility test medium
Leifert & waites无菌测试培养基
Luria Broth Agar, Miller
Luria Broth Base, Miller
麦芽琼脂培养基
mCS20ABN Medium
mCS20ABN 培养基
mD5A Medium
mD5A 培养基
mFS Medium
mFS 培养基
mKM Medium&
mKM 培养基
MSP Medium
改良的蔗糖蛋白胨培养基
mTBM medium
改良的TBM培养基
mTMB Medium&
改良的TMB培养基
mXCP1 Medium
改良的XCP1培养基
MXV medium
MXV 培养基
Peptone water
PSM medium
PSM 培养基
PTSA Medium
蛋白胨酪氨酸氯化钠琼脂培养基
SCM Medium&
SCM 培养基
SNAC medium
SNAC 培养基
YDC medium
YDC 培养基
(DL)-Malic acid
(DL)-苹果酸
2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside
2-硝基苯-β-D-半乳糖苷
Acetylsalicylic acid
乙酰水杨酸
腺嘌呤核苷
Adenosine-5-triphosphate
三磷酸腺苷（ATP）
Aluminium chloride hexahydrate
六水合氯化铝
Ammonium chloride
Ammonium dihydrogen phosphate
磷酸二氢铵
Ammonium nitrate
Ammonium sulphate
Banana powder
BES 缓冲液
Bis-Tris buffer grade
Bis-Tris 缓冲液
Boric acid
Calcium carbonate
Calcium chloride dihydrate
二水合氯化钙
Calcium citrate tetrahydrate
四水柠檬酸钙
Calcium gluconate monohydrate
葡萄糖酸钙
Calcium nitrate tetrahydrate
四水硝酸钙
Calcium phosphate tribasic
Casein hydrolysate
水解酪蛋白
Cetrimide (N-tetradecyl-N,N,N-trimethylammonium bromide)
十四烷基三甲基溴化铵
CHAPS& 缓冲液
Charcoal activated
Choline chloride
Citric acid monohydrate
一水柠檬酸
Cobalt chloride hexahydrate
六水氯化钴
Colchicine&&&&
Cupric sulphate pentahydrate
五水硫酸铜
Cyanocobalamin
Cysteine HCl monohydrate
一水半胱氨酸盐酸盐
D(+) Pantothenate
D(+)-Biotin
D-Fructose
D-Galactose
D-Glucose monohydrate
一水葡萄糖
D-Luciferin
D-Mannitol
D-Sorbitol
Dextran sulphate sodium
葡聚糖硫酸钠
di-Potassium hydrogen phosphate
磷酸氢二钾
Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate
二水合磷酸氢二钠
Dimethylsulfoxide (DMSO)
Dithioerythreitol (DTE)
DTE/二硫赤糖醇
Dithiothreitol (DTT)
DTT/二硫苏糖醇
EDTA disodium dihydrate
二水乙二铵四乙酸二钠盐
Fe-EDDHA (Ethylenediamine di-2-hydroxyphenyl acetate ferric)&
Ferrous sulphate heptahydrate
七水硫酸亚铁
Folic acid
Folinate calcium pentahydrate&
亚叶酸钙五水化合物
Gluthatione reduced
还原型谷胱甘肽
Guanidine HCl
L-Arginine
L-Ascorbic acid
L-Asparagine monohydrate
一水合门冬酰胺
L-Aspartic acid
天门冬氨酸
L-Glutamic acid
L-Glutamine
L-谷氨酰胺
L-Histidine
L-Isoleucine
L-异亮氨酸
L-Lysine HCl
L-精氨酸盐酸盐
L-Methionine
L-Ornithine HCl
L-鸟氨酸盐酸盐
L-Phenylalanine
L-苯丙氨酸
L-Threonine
L-Tryptophan
L-Tyrosine
Lactose monohydrate
乳糖一水合物
Magenta-GlcA cyclohexylammonium salt
Magenta-GlcA
Magnesium chloride hexahydrate
六水氯化镁
Magnesium sulphate heptahydrate
七水硫酸镁
Malt extract
麦芽提取物
Maltose monohydrate
麦芽糖一水合物
Manganese sulphate monohydrate
一水硫酸锰
MES monohydrate
一水吗啉乙磺酸/MES
MUG trihydrate
MUG三水合物
Myo-Inositol
N-Cetyl-N,N,N,-Trimethyl Ammonium Bromide
Nicotinamide
Nicotinic acid
Nitro Blue Tetrazolium (NBT)
Oxytetracycline HCl
盐酸土霉素
p-Aminobenzoic acid
对氨基苯甲酸
p-Nitrophenyl-β-D-glucuronide
Phloroglucinol
Polyethylene Glycol 400
Polyethylene Glycol 4000
Polyethylene Glycol 6000
Polyoxyethylenesorbitan monolaurate
Polyoxyethylenesorbitan monooleate
Polyvinyl pyrrolidone (PVP 10)
Potassium chloride
Potassium dihydrogen phosphate
磷酸二氢钾
Potassium hydroxide
Potassium iodide
Potassium nitrate
Potassium sulphate
Propyleneglycol
Pyridoxine HCl
盐酸吡哆醇
Raffinose pentahydrate
五水棉籽糖
Riboflavine
核黄素/维生素B2
Salicylic acid
Salmon Gal
Salmon Gal
Salmon-XGlcA cyclohexylammonium salt
Salmon-XGlcA
Silver nitrate
Sodium alginate&
Sodium chloride
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate
二水合磷酸二氢钠
Sodium dodecyl sulphate (SDS)
Sodium hydroxide
Sodium molybdate dihydrate
二水钼酸钠
Sodium nitrate
Sodium thiosulphate
硫代硫酸钠
Soya peptone
大豆蛋白胨
Spermidine
SSC-buffer
SSC 缓冲液
SSPE-buffer
SSPE 缓冲液
Starch from potatoes
马铃薯淀粉
Sucrose&&&&
氨基乙磺酸
TBE buffer
TBE 缓冲液
Thiamine HCl
盐酸硫胺素
Trehalose Anhydrous
无水海藻糖
tri-Sodium citrate dihydrate
二水合柠檬酸三钠
Triethanolamine
TRIS ultrapure
TRIS （超纯）
X-Glc sodium salt trihydrate
X-Glc 三水合钠盐
X-GlcA cyclohexylammonium salt
X-GlcA 环已胺盐
X-phos disodium salt (BCIP disodium salt)
BCIP二钠盐
X-Phos p-Toluidine salt (BCIP p-Toluidine salt)
对甲苯胺蓝
Yeast extract
酵母提取物
Zinc sulphate heptahydrate
七水硫酸锌
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药用植物细胞组织培养学2014,含最新研究成果。
药用植物细胞组织培养学时 45 理论 27 实验18主 讲 俞年军 安徽中医药大学 药学院 生药系 2014年2月--4月第一章? ? ?绪论植物细胞组织培养的概念 植物细胞组织培养的发展简史 植物细胞组织培养在药用植物生产上的应 用<
br />第一节 植物细胞组织培养相关的概念一、植物细胞组织培养的概念1、植物细胞组织培养（plant cell and tissue culture):是指在离体条件下利用人工培养基对植物 器官、组织、细胞、原生质体等进行培养使其长 成完整的植株。而研究对象为药用植物，则是药 用植物细胞组织培养。 2、愈伤组织 (callus)：在植物细胞组织培养中， 指在人工培养基上由外植体形成的一团无序生长 的薄璧细胞。
?3、脱分化（dedifferentiation）在细胞组织培养中，一个成熟细胞或分化细胞转变成分生状态 的过程，即形成愈伤组织过程 。?4、再分化（redifferentiation ）： 植物的成熟细胞经历了脱分化之后，由愈伤组织形成完整 的植株，这一过程叫做再分化，或分化或再生。?5、外植体（explant）：在植物细胞组织培养中，由活体植物体上提取下来的接种在培养基上的 无菌细胞、组织、器官等均称外植体。?6、细胞全能性（totipotency）：是指一个 完整的植物细胞拥有形成一个完整植物所必 须的全部遗传信息，在一定条件下，可以发 育成完整的植株。 这是德国的植物生理学家Habenlandt在 1902年提出的观点。二、植物细胞组织培养类型和过程?1、植物细胞组织培养类型材料分类 器官培养 细胞培养 原生质体培养 愈伤组织培养材料研究特点 愈伤组织培养 细 胞 培 养 器 官 培 养 原生质体培养最为常见的组织培养悬浮细胞培养单细胞培养胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、 叶、花和幼果的部分组织的培养研究比较活跃??2、植物细胞组织培养过程外植体（细胞） 愈伤组织? ?完整植株不定器官 体细胞胚第二节 植物细胞组织培养的发展简史一、探索阶段（1902----1930中） 德国的植物生理学家Habenlandt(哈勃兰特）在1902年 提出高等植物的器官和组织可以不断分割，直到分到单个 细胞而不影响细胞增殖的观点，并设想离体细胞具有再生 完整植株的潜力。 （一）德国的植物生理学家Habenlandt 的实验： 实验材料：小野芝麻和凤眼兰的栅栏组织，和虎万年青属 植物的表皮细胞。 实验结果：细胞有生长，但没有长成植株，实验失败。 失败的原因：1、实验材料是已经高度分化了的细胞 2、培养基过于简单。 评价：是植物组织培养的先驱，为植物细胞组织培养奠定基础。Haberlandt：观点： 高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞贡献：提出细胞全能性首次进行离体细胞培养小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞Knop+蔗糖无分裂细胞高度分化+培养基中无生长激素（二）有突破性实验?1、胚培养实验：1904年Hanning培养了萝卜 和辣根菜的胚。2、根尖培养：1922年，美国的Robbins(罗布 林）和德国的kotte（科特）分别报道了培养 离体的根尖获得成功。这是在无菌条件下进 行器官培养的最早实验。?二 奠基阶段（年）1934年：White番茄根 建立第一个植物无性系。当根2厘米长－切成 0.5-1厘米切断，无菌液 体培养－完全相同的离体 根－根离体培养真正成功。提出植物细胞全能性假设。1、White培养基的形成和无性系的建立 1933年我国学者李继侗和沈同，进行了 银杏的胚培养取得成功。 1934年美国的White用番茄根尖进行培养， 获得成功植株；1937年他在培养基中加入 了三种B族的维生素，使得培养获得成功；------ White培养基 实验结论：必须有适宜的培养基才能成功。2、植物细胞培养的两个重要发现 （1）：认识了B维生素 （2）：发现了生长素1937年美国的White培养基中加入：吡哆醇（B6）硫胺素 （B1）烟酸（B5），促进了胚细胞的形成。 1939年Gauthenet(法国生物学家）在培养基中加入了 IAA， 发现对形成层的组织的生长显著的增加。 1941年Overbeek在培养基中加入了椰子汁； 1944年 Skoog研究腺嘌呤或腺苷，可以促进愈伤组织的生长； 1955年Miller等发现了激动素（6-呋喃氨基嘌呤）； 1958年Steward报道在胡萝卜根韧皮部细胞培养中形成了体 细胞胚，并形成了完整的植株。证明了植物细胞的全能性。三、迅速发展阶段（1970-至今）1、原生质体培养取得重大突破 1960年Cocking等用真菌纤维素酶分离了原生质体 1971年Takebe烟草：原生质体 再生植株 结论：原生质体与生殖细胞相同 2、细胞融合技术产生：促进了体细胞融合技术的发 展。 3、花药培养取得显著成绩 获得了物种数目不断增 加。尤其在作物上取得了成功。4、离体快繁和脱毒技术得到广泛应用 1960年快繁方法提出，很快在花卉中形成 了“兰花工业”，产生了可观的经济效益。 药用植物的主要是利用其进行脱毒苗的生 产，解决品种退化和栽培种苗问题。如菊花、 半夏等。 5、与分子生物学联姻，产生了转基因育种技 术。第三节 组织培养与药用植物生产的关系一、在植物育种上的应用 1、单倍体育种 1966年Guha和Maheshwari 获 得世界上第一个毛曼陀罗的单倍体植株，目前世 界上有300多种植物获得培养成功。 2、体细胞杂交、打破物种间的生殖隔离，实现 有益基因的交流，改良作物、药用植物的栽培品 种。 3、基因工程和遗传转化：实现了转基因植物。?二、在植物脱毒和离体快繁上的应用 1、植物脱毒（Virus-free）：利用植物生 长点附近的病毒浓度低甚至无病毒的特性，培 养脱毒植株。这种方法称植物脱毒或植物脱毒 技术。 2、离体快繁（in vitro propagation）：是 利用植物细胞全能性的特性，培育出新的植株 的方法。现在广泛的应用到花卉、作物和药用 植物的种苗生产上。
三、在药用植物次生代谢产物生产上的应用利用植物细胞组织大规模培养，可以高效生产天 然化合物。人参的细胞培养，提取人参皂苷、红豆 杉细胞培养，提取紫杉醇等。 注意研究要点：1、建立该物种的培养方法 2、高产细胞植株筛选 （参阅：《红豆杉细胞培养生产紫杉醇》华中科技大 学出版社）四、在植物种质资源保存和交换上的应用利用植物细胞组织培养进行离体低温或冷冻保 存，还可以进行国际间的交换。 五、在遗传、生理、生化、病理等研究上的应用 1、利用花粉或花药的培养获得单倍体植株和纯 合二倍体植株，研究基因性质和作用，获得遗传材 料。 2、利用单细胞或原生质体的培养获得植株，可 以进行快速鉴定植物的抗病性、抗逆性等。
? ??? ?思考题 1 概念：植物组织培养、愈伤组织、外植 物体、脱分化、再分化。 2 为什么说愈伤组织是最为常见的培养方 式？ 3 组织培养的类型有哪些？ 4 组织培养在农业上的应用有哪些？参考书目《植物细胞组织培养》主编 刘庆昌等中国农业大 学出版社 2002年7月 ? 《植物组织培养导论》M.K.Razdan 肖尊安，祝 扬 译2006年5月 化学工业出版社 《植物组织培养教程》李浚明，朱登云 编译中国农 业大学出版社 2005年9月第三版 《红豆杉细胞培养生产紫杉醇》华中科技大学出版 社2003年10月?第二章 药用植物组织培养的基本技术引言 一个标准的组培实验室应当具备必需的设备 1、各种实验的器皿：玻璃器皿、塑料器皿等清洗和贮备。 2、培养基的制备、灭菌和贮存 3、植物无菌操作 4、温度、湿度、光照的条件 5、培养物的观察 一般要有至少两个房间：培养基制备室、培养室水槽天平冰 箱超 净培 养 瓶 架烘 箱工 作 台仪 器 药 品 柜工 作 台灭 菌 待 用 培 养 瓶 架培养架培养架缓冲 间化学实验室 无菌室推 拉 门 培养室?第一节 实验室的设备一、培养基制备室1、工作台 2、低温冰箱（短期贮备） 3、普通冰箱 4、大塑料瓶 5、天平 6、电热磁力搅拌器 7、酸度计 8 、真空棒 9、恒温水浴或电炉 10、高压灭菌锅
卧 式 灭 菌 锅超 静 工 作 台酸 度 计显微镜显微镜玻璃器皿及用具 玻璃器皿 培养用的：试管、三角瓶、培养皿等； 显微镜下观察用的：细胞微室、载玻片、培养皿等。 ? 微孔过滤器（细胞过滤器）：用于激素灭菌。 ? 一般用石棉滤膜 二、无菌操作室（区） 现在的实验室多数使用的为超净工作台 工作台的组成：一个发动机（带动风扇） 粗过滤器 高效的细过滤器（
0.3ūm ) 其风速（27m/min左右)?三、培养室1、培养室的温度 应当是可控的，一般在25±2 ℃。 也可以用培养箱。 2、培养室的光照 一般在散射光下培养，但要求可以 控制。有时要求进行暗培养。 3、培养室的湿度 一般应在＞50%的相对湿度条件。 4、培养架:一般要求透光、或带有一个小风扇。
?四、培养容器一般多为玻璃仪器，应使用硼硅酸器皿，钠 玻璃不应使用。现在市场上也有各种塑料制品， 应根据实际情况选用：耐高温的、一次性无菌等。 培养用的：试管、三角瓶、培养皿等； 显微镜下观察用的：细胞微室、载玻片、培养皿等。 ? 微孔过滤器（细胞过滤器） ：用于激素灭菌。 ? 一般用石棉滤膜
＞第二节 实验技术一、玻璃器皿、塑料器皿的清洗1、清洗 传统是用（重铬酸钾和浓硫酸的混合 液）浸泡月4小时，然后用自来水彻底冲洗。最 后用蒸馏水冲洗干净 2、污染物的处理 受污染的往往先灭菌处理再 清洗。 3、干燥 清洗好的器皿放在烘箱中干燥大约温 度在75℃。二 灭菌植物培养基因为含有糖，可以供很多微生物生长， 因此必须进行灭菌处理。一般培养基的污染的可能来 源有:（1 培养基的容器 2培养基本身 3 外质体 4 接种 的环境 5 使用的操作器械 6 环境） （一）培养基灭菌 一般应在1.06K/cO(0.105MPa)压力下（121℃）消 毒15~20（40）min，灭菌作用取决温度而不是直接 取决压力。 注意只有当压力指针到零时，才能打开灭菌锅。 另外容器体积大的灭菌时间应长一点。 不能高温灭菌的可以采用滤膜过滤进行灭菌。使 用孔径为0.45或更小0.22um细菌滤膜。（二）玻璃器皿、塑料器皿和器械的灭菌1、玻璃器皿、塑料器皿 可用高温消毒，一 般在121 ℃下灭菌。玻璃器皿还可以干热灭菌 160~180 ℃下3小时。 2、器械 如镊子、解剖刀等 可以用70%的 酒精消毒，或用火焰灭菌，一般用95%酒精浸泡 更好。（三）植物材料灭菌对于这些材料根据实际情况来定防案。一般外质体较 大而硬容易操作。一些表面消毒剂的消毒效果如表格消毒剂 次氯酸钙 次氯酸钠 过氧化氢 使用浓度 5%~10% 2% 10%~12% 消毒时间 5~30 5~30 5~15 效果 很好 很好 好溴水硝酸银 氯化汞 抗生素1%~2%1% 0.1%~1% 4~50J/L2~105~30 2~10 30~60很好好 满意 相当好乙醇或异丙醇消毒 对植物组织可以用乙醇或异 丙醇进行表面消毒，一般在数秒钟后，放在超净 工作台上，把乙醇或异丙醇蒸发掉。因此在实际 生产上多用乙醇消毒，不需要用无菌蒸馏水冲洗。整体消毒 对于取材部分进行组织培养，可以 进行先整体消毒，然后进行无菌条件下取材。如 花药、子房、胚乳等。四、无菌操作区? ? ?? ?1、注意污染物的防控 2、操作间应关闭门窗 3、操作人员应该彻底消毒洗净，不要让手背放在 无菌容器上方。 4、物品应该放在台后，台面不应放的东西太多。 5、实验材料尽可能一次性放到超净工作台内1、防止消毒剂对健康的损害 2、防止紫外灯对眼睛、呼吸系统的伤害 3、注意有机溶剂易燃问题，防止引起火灾。第三节 培养基一 概述在离体培养条件下，不同的植物的组织对营养有不同的 要求，甚至同种植物不同部位其培养基的组成成分也是有差 异的。 因此寻找到一种满足该组织或器官的培养基，是组织培 养的核心工作。培养基的浓度表示 国际上使用摩尔值来表示，摩尔等于在一种物质的分子式中以克表示的各个原子质量的总和。 （1 mol/L=1000mmol/L=1000000umol/L)二、培养基的成分? ? ? ? ??大量元素 微量元素 氨基酸和有机附加物 植物激素（植物生长调节剂） 维生素类 凝固剂大量元素（以MS培养基为例）序号1 2 3 4 5化学式KNO3 NH4NO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCL2.4H2O化学名称硝酸钾 硝酸铵 磷酸二氢钾 硫酸镁 二氯化钙用量mg/L0 370 440微量元素（以MS培养基为例）序号 化学名称1 2 3 4 5 6 7 碘化钾 硼酸 硫酸锰 硫酸锌 钼酸钠 硫酸铜 氯化钾化学式KI H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCL2.6H2O用量 mg/L0.83 6.2 22.3 8.6 0.25 0.025 0.025氨基酸和有机附加物（以MS培养基为例）序号1 2 3 4 5化学名称肌醇 甘氨酸 盐酸硫胺素 盐酸吡哆醇 烟酸化学式C6H12O6.2H2O NH2.CH2.COOH C12H17CLN4OS.HCL C8H11O3N.HCL NC5H4COOH用量 (mg/L) 1002 0.1 0.5 0.5植物激素（植物生长调节剂）? ? ?? ? ?1、生长素类：IAA，IBA，2，4-D，NAA等。 2、细胞分裂素类：KT，6-BA，Z T等。 3、赤霉素类；GA1-GA4，GA7，GA9-GA16， GA24，GA25等 4、脱落酸：ABA 5、乙烯6、PH值：5.6-5.8三 培养基的种类、配方及其特点?（一）按性质分 1、基本培养基MS、ER；全面型； SH 、 B5 （高钾型）； HE（欧洲普遍采用，低盐型）2、完全培养基基本培养基＋ 其它成分（激素、有机物质等）（二）按状态分:固体培养基；液体培养基。（三）按作用分：诱导培养基；增殖培养基、生 根培养基。 （四）按培养过程分：初代培养基、继代培养基。培养基配方?参见课本P267培养基的配制? ?母液（储备液）的配制与保存 培养基配制MS母液（储备液）的配制与保存成 分 用 量(g/l) ８２.５ ９５.０ １８.５ ４４.０ １７.０ ０.０８２ ０.６２ ２.２３ ０.８６ ０.０２５ ０.００２５ ０.００２５ 每升培养基取用量(ml) 母液1（大量元素） NH4NO3 KNO3 MgSO4.7H2O CaCL2.2H2O KH2PO4 母液2（微量元素） KI H3BO3 MnSO4.4H20 ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCL2.6H2O２０１０ １０１０成分用量（ｇ／ｌ） 每升培养基用量（ｍｌ）母液3（铁盐） FeSO4.7H2O Na2.EDTA.2H2O２.７３ ２.７８１０母液4（维生素、氨基酸） 肌醇 烟酸 盐酸吡哆醇 盐酸硫胺素 甘氨酸１０.０ ０.０５ ０.００１ ０.０５ ０.２１０培养基的配制1、在洁净的不锈钢锅里放入750ml蒸馏水，加入所 需要的琼脂和糖，加热熔化。 2、加入储备液1－４０ｍｌ，储备液2、３、４各 １０ｍｌ，按需要量加入植物激素。 3、用蒸馏水定容到1L。 4、调ｐH值。ＰＨ一般５.８ 5、培养基的分装。 6、包扎。 7、培养基的高压灭菌。培养基的灭菌??高温高压蒸汽灭菌：121℃，1.1Kg/cO， 15-20分，时间过长，培养基成分易变性 失效 过滤灭菌：在高温高压下易分解的培养 基和激素类外植体接种全过程酒精擦拭手外植体消毒浸泡5min器械消毒酒精灯灼烧酒精擦拭培养皿酒精擦拭旋转灼烧取外植体修剪外植体接种盖好瓶塞
四、污染的原因及其预防措施 1、污染植物组织培养过程中培养基 和培养材 料滋生杂菌，导致 培养失败的现象2、污染的原因一是病原菌污染（细菌、真菌） 二是外植体、培养基、培养器 皿带菌 三是操作人员未遵守操作规程。真菌污染
污染的预防措施组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环 节。预防措施有： 防止材料带菌-----选择取材时间、材料与培养、外植体灭菌 等措施； 防止用具带菌----器皿与金属器械灭菌； 操作室要处于无菌状态----工作室、培养室灭菌等； 操作人员要按照操作程序进行。 在培养基中加入抗菌素 分散接种???? ? ?假设污染率为95%：? 100块材料，接种于100支试管，即1块/支。 得率为：P=（1-95%）?100=5块无菌材料? 200块材料，接种于100支试管，即2块/支。P1（2污）=95% ?95%=90.25% P2（1污1得或1得1污）=2 ? 95%?5%=9.5% P3（2得）=5% ? 5%=0.25% 若得到1支试管的无菌材料，至少要接种：1/0.25%=400支，即接种800块材料，能得2块 无菌材料。? 若按3块/支接种，需做8000支试管培养基，接入2.4万 块材料，才能有1支试管的（得3块）无菌材料。五、外植体的褐变及其防止措施1、褐变褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧 化酶被激活后，使细胞内的酚类物质氧化成棕 褐色醌类物质。 这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培 养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活 性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最 后变褐而死亡的现象。2、影响褐变的因素????植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量高的植 物易发生褐变 。 外植体的生理状态：一般幼龄材料，幼嫩器官和组 织，春季取外植体，褐变发生较轻 。 培养基的成分：培养基中6-BA或KT能促进褐变发 生，而生长素类如IAA可减轻褐变发生。 材料转移时间：3、褐变的防止措施??? ? ?选择适宜的外植体及最佳培养基：适当降低 培养基无机盐浓度，降低PH值，降低细胞分 裂素水平等，可显著减轻培养物褐变。 连续转移 加抗氧化剂：如硫代硫酸钠、抗坏血酸； 加活性碳 加多胺类物质，如精胺、亚精胺六、培养物的玻璃化现象及其预防措施1、玻璃化现象及其产生原因?概念： 试管苗生长异常，叶、嫩梢呈透明或半透明的水浸 状，整株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷伸。可能原因： （1）细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高； （2）培养基中离子种类，比例不适； （3）琼脂浓度低， （4）不良培养环境如温度过低或过高； （5）光照时间过长及通气不良。?结果：易造成组培苗含水量高，茎叶透明，出现畸形，发生玻 璃化现象 。2、玻璃化现象的预防措施? ? ??? ? ?适当控制培养基中无机盐浓度 适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 增加自然光照，控制光照时间 控制好温度 改善培养皿的气体交换状况 在培养基中添加其他物质思考题1、培养基的类型有哪些？ 2、培养基的主要成分有哪些？各有何作用？ 3、什么是组织培养污染？如何进行预防？ 4、简述植物组织培养中褐变发生的原因及其防 止措施？ 5、什么叫玻璃化现象？第三章细胞的全能性与器官的发生第一节 细胞的全能性和愈伤组织 一 、概念 1、细胞全能性（totipotency）：是指一个 完整的植物细胞拥有形成一个完整植物所必须的 全部遗传信息，在一定条件下，可以发育成完整 的植株。 一个成熟的细胞要经历两个阶段才可以表现出 全能性。2、脱分化（dedifferentiation）在细胞组织培养 中，一个成熟细胞或分化细胞转变成分生状态的 过程，即形成愈伤组织过程 。 3、再分化（redifferentiation ）： 植物的成熟细 胞经历了脱分化之后，由愈伤组织形成完整的植 株，这一过程叫做再分化，或分化或再生。二、愈伤组织形成的条件 正常细胞 离体细胞 织。 受到细胞协调控制 摆脱控制，产生愈伤组愈伤组织形成的条件：激素的种类和浓度 常用的生长素：吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸 （NAA）、2，4―D等。 常用的细胞分裂素：细胞分裂素（KT、6-BA）三、愈伤组织形成不同时期外植体 中已分化的活细胞在外源激素的诱导 下通过脱分化后形成愈伤组织。可以划为三个时期： 诱导期（起动期）、分裂期、形成期。 1、诱导期： 是外植体细胞进行分裂准备的时 期 。现代研究表明，细胞大小没有多大变化，但细 胞合成代谢活跃，时间有长有短。（测定RNA的含 量）2、分裂期：经过诱导期后，外植体外层细胞开始迅速分 裂，中间部分细胞不分裂，形成一个禁止的芯。这时细 胞分裂速度大大超过伸展速度，细胞体积小，逐渐回复 到分生状态。形成了愈伤组织。3、形成期：是指外植体细胞经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。一般细胞大小相对稳定。四、愈伤组织增殖的方式 一般愈伤组织的生长是发生在不和培养基接 触的表面。数周就形成不规则的菜花状组织。 如烟草在8周时间内，增重16倍左右。五、愈伤组织状态的调控来源于不同植物或同一种植物不同部位的 愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能 存在差异。如光滑、粗糙，有没有胚性等。优良的愈伤组织必须具备以下特性：1、旺盛的自我增殖能力，可以建立大规模的愈 伤组织无性系。 2、容易散碎，有利于建立愈伤组织的悬浮系， 和分离出全能性的原生质体。 3、高度的胚性或再分化能力，可以得到再生植 株。 4、经过长期继代保存而不丧失胚性。六、诱导愈伤组织时通常采取的策略1、选择适当的基因型和适当的外植体。 2、选择正确的培养基，特别是植物激素的种类 和浓度。 3、采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱导 培养基。如加入硝酸银，使组织内乙烯的作用受 抑制。第二节 细胞分化（微管组织的分化）一、影响微管组织分化过程的因子 1、生长素 低浓度的生长素能刺激木质部的发生。 生长素浓度和木质部分化程度之间存在着反比关系。 （茎尖嫁接试验证明） 2、蔗糖 蔗糖的浓度对木质部和韧皮部的形成有一 定的刺激作用。不同浓度的蔗糖对洋丁香微管组织分化的影响（生长素的浓度0.05J/L）蔗糖（%） 1% 2% 2.5-3.5% 4%韧皮部 不分化 很少形成或不分化 分化 分化木质部 少量 有利于形成 分化 很少或不分化另外、二糖的麦芽糖和海藻糖能刺激愈伤组织的形成。单糖无 刺激作用。 3、细胞分裂素和赤霉素 细胞分裂素对木质部的形成肯定有作用。如在培养基中加 入10-7g,使烟草中导管的分化提高30%。 细胞分裂素和生长素有协同作用，促进导管的分化。 对导管的分化，生长素和赤霉素存在刺激的相互作用。 4、物理因子 温度在17~31℃，木质部的形成随着温度增加而增加。 光照：对创伤的导管形成有刺激作用。二、细胞分裂对木质部分化的必要性学者的观点：细胞分裂,才出现木质部分子的分化。刺激木质部分裂的化学因子（生长素和细胞分 裂素、蔗糖等），同样也促进细胞的分裂。 细胞分裂，是否是木质部分子的分化的前提， 还是有争论问题，有待于深入研究。第三节 器官分化（根和茎的分化）一、概述 由培养细胞再生完整植株是细胞脱分化之后又再 分化的结果。再分化有两种不同的方式：是通过茎芽的分 化（器官的发生）或通过体细胞胚胎发生。 在组织培养中，通过器官发生途径产生再生植株的基本 方式有三种： 1、先分化芽，待芽伸长后，在其幼芽基部生根，这是组 培中最常见的情况； 2、先分化根，再在根上长芽，形成完整的植株； 3、在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后二着的 维管束组织相互连接，成为统一的轴状结构的小植株。二1、化学因素影响茎芽分化的因素在培养中茎芽和根的分化取决生长素/细胞分裂素的比例。 实验显示：激动素导致芽的分化和发育，生长素类抑制芽的 形成。2、物理因素（1）光照 包括光强、光质和光周期，对器官分化有重要 影响。一般培养物适宜的光强lx，如紫外和蓝紫 光促进芽的产生，而红光显著促进生根。而光周期在12~16 小时为易。 （2）温度 25℃左右的培养适宜器官发生，一般接近原产 地的温度比较有利于植物的生长，热带植物27~30 ℃，喜冷 凉植物18~22 ℃。(3) 湿度一般适宜的湿度在70~80%，增加湿度有利于生根。湿度 过低会间接引起培养基失水，影响培养的效果。三、植株材料（1）品种基因型的差异 这在培养花药时表现最明显。一般二 倍体较好；多倍体、非整倍体可以使器官分化丧失。 （2）材料的生理状况 一般幼年的苗，比成熟的反应好。在木 本植物最明显。 （3）不同的器官分化类型 枸杞外植体的器官分化，芽原基 的分化较难，而根的分化较容易。思考题? ??? ?1、愈伤组织、细胞全能性 2、愈伤组织形成的过程？ 3、优良愈伤组织标准是什么？ 4、 愈伤组织诱导方法和策略是什么？ 5 、影响器官分化的因子有哪些？第四章 体细胞胚胎发生及培养第一节 体细胞胚胎发生一、概述 1、 胚的形成：受精作用能触发或刺激卵细胞（受精后称 做合子）进行分裂并发育成胚（胚的发育过程叫做胚胎发 生）。一般历经球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚， 最后形成成熟胚。 2、体细胞胚 是指植物组织培养中起源于1个非合子细胞， 经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的胚状结构。 原胚期 球形胚 心形胚 鱼雷胚 子叶胚。
二、胚状体的特点 1、具有明显的两极性 愈伤组织 生根 发芽 为单极性 胚状体具有胚根和胚芽，类似合子发育中的种 子结构。 2、遗传稳定性 起源于单细胞或细胞团，一旦 形成就完成了分化，结构稳定。不要长时间的脱分 化和再分化。成苗率高，是人工种子的良好材料。?3、发生数量大，增殖率高植物胚状体形成后，在适宜条件下可以再生胚 状体，即形成大量次级胚状体。三、体细胞胚发生的途径及类型1、体细胞胚发生的途径 有两类：直接途径和间接途径 直接途径：就是从外植体某个部位直接分化 出体细胞胚。如山茶的子叶在培养中可直接从子 叶基部的表皮细胞产生胚。 间接途径 培养材料在培养条件下，先形成产 生愈伤组织，其后在愈伤组织表面分化形成体细 胞胚。
2、体细胞胚发生的类型（1）外植体上直接发生二倍性体细胞胚 （2）愈伤组织产生胚状体 （3）悬浮细胞产生胚状体 （4）单倍体胚胎发生类型
四、影响体细胞胚胎发生的因素现在公认的影响因素是培养基的两种成分即是生长素和氮源。 1、生长调节物质胚性细胞团的产生：愈伤组织的建立和增殖，需要含 有生长素的培养基，反复培养并不能形成胚。 胚的产生：把胚性细胞团转移到生长素含量少或没有 的培养基上，出现了成熟的胚。 连续在无生长素的培养基上培养，愈伤组织就不能产 生胚。 结论 ：生长素的存在对形成胚性细胞团和胚是必要的2、氮源 培养基中氮源的形态也会显著影响离体 条件下的胚胎发生。 实验：野生胡萝卜叶柄节段培养，只有当培养基 中含有一定数量的还原态氮，才能产生胚。 用KNO3唯一的培养基，不能产生胚，因此 NH4+存在对产生胚是重要的，或者胚的发生率 较高。 一般还原态和氧化态的氮最合适的比例是： 10mmol/L NH4Cl和40mmol/L KNO33、其他因子 据Brown等（1976），报道：高浓度的钾（20 mmol/L）是胚胎发生所必须的。 在培养基中，溶解氧的含量应低于一个临界 （1.5mg/L) ，否则有利于生根。 挥发性或非挥发性物质，可以抑制胚胎的发生， 如乙醇；IAA，ABA和GA3。 加入活性炭可以提高细胞胚胎发生的频率。第二节 胚培养一、 胚培养的意义 1、 用于胚的挽救 可以克服远缘杂交难以成 功，合子胚发育不良和中途败育。 2、打破种子休眠 通过幼胚的培养，可以使 休眠的种子提高萌发成苗，缩短育种周期或加速 良种繁育。 3、克服珠心胚的干扰 有些植物除了有正常的 胚，还有从珠心组织发生多个不定胚。利用胚培 养，可以排除珠心胚的干扰，获得杂种胚，提高 杂交育种的效率。如柑橘多胚性植物。4、诱导胚状体及胚性愈伤组织利用植物幼胚或其它胚胎组织培养，可以产生 大量次生胚状体从而用于快速繁殖。利用胚胎培养 可以产生大量胚性愈伤组织，特别是胚胎发生技术， 是研究人工种子的重要基础。 5、种子生活力的快速测定 对于木本植物种子后熟期长，破除休眠需要层积。 研究发现：层积或未层积的胚离体培养发育一致， 可以用于种子生活力的快速测定。二、胚培养方法1、成熟胚的培养（1）外植体消毒与接种 一般对种子或果实进行表 面消毒，然后把胚取出，放到培养基上培养。 （2）培养基 一般条件不高，提高一些简单的营养 液即可。 （3）培养的外部条件 一般光照12小时/每天，温 度在25~30℃，有些休眠种子先在4 ℃处理一段时 间，然后转入正常培育。2、原胚培养原胚是指未成熟的幼胚。一般胚龄越大成功率越高。 （1） 注意培养基的成分 合适的培养基是首要条件 ， 无机氮以硝酸盐、亚硝酸盐或铵盐的形式。有时要降低 硝酸盐浓度，提高k+ Ca2+的浓度。 蔗糖是效果最好的碳源之一，但要注意浓度的变化。 2%~12%，幼胚浓度高，成熟浓度低。 （2）注意生长调节剂和其他附加物 植物离体胚培养中，生长调节物质应用有一定的特 异性，添加不当，可能改变胚胎的发育方向。如在培养 荠菜的球形胚的正常发育时，必须补加IAA，激动素和 硫酸腺嘌呤。 银杏胚乳的提取物对胚发育有促进作用。另外发现， 椰乳、酵母的提取物，也有促进胚的生长作用。第三节人工种子的应用一 概念 人工种子又称人造种子，这是细 胞工程中最年轻的一项新兴技术。最初是由 英国科学家于1978年提出的。他认为利用体 细胞胚发生的特征，把它包埋在胶囊中，可 以形成具有种子的性能，并直接在田间播种。二 人工种子组成人工种子是由 体细胞胚、人工胚 乳和人工种皮三个 部分组成。三 人工种子的制造1、人工种皮：一般选用藻酸钠（2%-3.2%W/V）， 和硝酸钙或氯化钙（100 mmol/L ）络合而成。 2、人工胚乳 在种皮基质中加入对体细胞胚有益物 质如：营养物质、生长调节物质、杀虫剂、用于 干旱播种的亲水性化合物。人工种子包埋示意图4%海藻酸钠体细胞胚包埋丸 2% CaCl人工种子 水四 人工种子的优点1 培养条件可以人为控制，具有省地省工可直接在田 间播种等优点。 2 在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长 调节剂、固氮菌、杀虫剂等。 3 用于制作人工种子的体细胞胚，可利用生物反应 器大规模培养，大大提高了效率。 4 一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基 因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产。五 人工种子存在的问题1 许多重要植物还不能培养出大量的高质 量的体细胞胚。 2 现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不 能有效地防止微生物的腐蚀。 3 人工种子的贮藏有待进一步完善。??? ? ?思考题 什么是体细胞胚？形成过程分为哪几个 时期？ 影响体细胞胚培养的因素有哪些？ 什么是人工种子，组成有哪些部分？ 什么是胚培养，有什么意义?第五章胚乳、子房、胚珠的培养第一节 胚乳的培养一、胚乳知识背景 胚乳是一种性质独特的组织； 组成特殊：3个单倍体核融合而成（1父本，2母 本）。 胚乳是一种研究形态发生学的好材料：一是三倍 体。二是均质的薄壁，完全没有维管组织的分化。?二、 胚乳愈伤组织的建立 胚乳大多数?愈伤组织 分化器官分化植株胚乳体积增大 形成可见愈伤组织表面细胞团 内层细胞团三、影响胚乳愈伤组织发生及其诱导频率的主要因素 1、胚乳发育时期的影响 （1）处于早期的胚乳，接种操作不便，愈伤组织 诱导频率很低。 （2）处于旺盛期的胚乳，最易形成愈伤组织。诱 导频率高达90~95%。 胚乳特点：胚分化完成，胚乳已形成细胞组织， 充分生长，达到了成熟时大小，外观为半透明的固 状体，富有弹性。 （3）接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱导 频率很低。如苹果的诱导频率为2-5%。?（1）培养基的类型 常用的为WT，LS、MS、N6等，其中MS使用频率最高。 另外还有一些有机物CH、YE。对于愈伤组织的诱导和生长 是必要的。 （2） 外源激素（不同植物反应不一致） ①在没有外源激素的培养基上，胚乳极少或不能产生愈伤 组织。如枸杞、苹果、橙等。 ② 有的在培养基上共同使用生长素和细胞分裂素的合理 搭配，才可以产生愈伤组织。如黄瓜的培养。 ③有的对添加植物激素的种类还有特殊要求如2，4-D添加， 可以对大麦胚乳产生愈伤组织，玉米素对猕猴桃胚乳培养 中，效果最好。 ④有的无需要任何激素，胚乳可以产生愈伤组织，如荷叶 芹等。2、培养基和激素的影响?3、胚在胚乳培养中的作用（1）未成熟胚乳，尤其是旺盛生长期的未成熟胚 乳，在诱导培养基上无须原位胚的参与就能形成愈 伤组织。 （2）完全成熟的种子或干种子，在诱导其脱分化 形成愈伤组织之前，必须借助于原位胚的萌发使其 活化。 （3）外源GA3能部分取代胚因子的作用三、由胚乳愈伤组织再生植株1、器官发生途径一般胚乳经过愈伤组织再形成茎芽。半寄生植物从胚乳组织分化茎芽必须加入外源 细胞分裂素。 自养植物，从胚乳培养器官经过愈伤组织阶段， 在2，4-D，激动素和YE的培养基上，形成愈伤组织， 再转移到基本培养基上，才能产生组织和器官的分 化。茎芽接下来如何诱导植株生根，再获得完整的胚乳再 生植株? 茎芽很细弱，经过壮苗培养，再诱导生根。当苗长2-5 M，切除其基部的愈伤组织，然后，转到无激素或含有一 定激素的培养基上培养生根。目前已培养15种植物以上， 其中药用植物有黄芩、杜仲、石刁柏等。2、胚胎发生途径在进行胚乳培养中，为了促进胚状体的发育和成苗， 除须对培养基中的激素进行调节，还应调节培养基盐的浓 度。 如柚：胚乳愈伤组织+MT+ GA3（1.0 J/L）的培养基 上以后，分化出球形胚状体，但不能继续生长，后转到 2MT+ GA3（2-15 J/L），最终获得胚乳的再生植株。四、胚乳再生植株的染色体倍性变异在胚乳培养中，胚乳愈伤组织及再生植株的染色体数常 常发生变化。中药枸杞染色体也表现了不同倍性细胞的嵌合 体。 影响染色体数稳定的因素 1、胚乳的类型 外植体的胚乳组织本身是一个多种倍性细胞 的嵌合体。 2、胚乳愈伤组织发生的部位 在合点端比珠孔端更为普通。 3、培养基中外源激素的种类和水平 例如 猕猴桃胚乳：在ZT （3.0 J/L）+NAA （0.5 J/L） 的培养基上，产生再生植株，不是3倍体。而在ZT （3.0 J /L）+2，4D （1.0 J/L）的培养基上，产生再生植株，是3 倍体五 胚乳培养的应用1、培养无籽果实植株 2、尝试改用胚乳培养的三倍体的途径 3、通过三倍体获得三体，以供基因定位 4、研究某些天然产物的生物合成第二节 离体授粉和体外受精一、概述 有性杂交是常规育种的一个主要手段。在自然 界不同植物花粉并不一定能够结实，存在受精障碍： 1、花粉管在柱头上不能萌发 2、花粉管不能进入胚珠 3、花粉管在花柱中破裂 另外还有受精后的障碍：胚乳和胚之间的不亲 合性或胚乳发育不良，杂种胚不能发育成熟。二、离体授粉的方式离体授粉 在离体条件下，把在裸露胚珠上授 粉而结实的方法称做“试管受精”，把离体条件下 通过在培养整个雌蕊的柱头上授粉而结实的方法称 做“离体授粉 ”。 有离体胚珠授粉、离体柱头授粉、离体胎座授 粉、离体子房授粉等不同方式。三、离体授粉的方法步骤： 1、确定开花、花药开列、授粉和受精作用的时间。 2、去雄后将花蕾套袋隔离 3、采集花粉粒 4、外植体消毒 5、将花粉在无菌条件下授于培养的胚珠、胎座、子 房、柱头。 成败的标志：形成有生活力种子。四、胚珠和子房的培养（一）胚珠的培养 胚珠培养需要复杂的条件。一般自花授粉植物的胚珠连 带胎座一道培养，直到种子形成，而异化授粉植物的胚珠， 只要最初的6~8天需要胎座，此后可以把胚珠转移到新鲜的 培养基上。 （二）子房的培养 1951年，Witsch发展了子房培养技术，将授粉后的子 房，在离体的条件下培育成果实。但比正常的要小。后来 在培养基上加入了VB。果实发育正常了。 在离体条件下花被或花冠对果实和胚胎发育起着重要作 用，没有会导致发育不良。??? ?思考题 1什么是胚乳培养、离体授粉？ 2影响胚乳组织诱导主要因素有哪些？ 3 胚乳如何诱导愈伤组织?第六章 单倍体的产生一、单倍体概述 1、单倍体 指的具有配子体染色体组成的孢子体 （n），即细胞染色体数为n。 ? 花药和花粉培养指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形 成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完 整植株。该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或 “雄核发育”。植物单倍体培养方法:? ?花药培养、花粉培养 胚珠或子房培养（未受精）2、单倍体在遗传育种上的意义（1）在细胞中只有1个染色体组，表现型和 基因型一致。 （2）缩短育种年限 用F1的花药培养获得 了大量花粉起源的单倍体植株后，经加倍成为 纯合二倍体。加速纯合的进程。常规育种需4-6年获得纯系，而小 孢子培养仅 需一年。供体植株 小孢子（n）花培 雄核发育花粉植 株（n）自然加倍 人工加倍纯合植株DH （2n）一年内获得纯系（3）提高了目标基因型的选择效率例子：二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株 常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能 将AAbb与Aabb、aAbb区分开。AB AB aB Ab ab AABB aABB AabB aAbB aB AaBB aaBB AabB aabB Ab AABb aABb AAbb aAbb ab AaBb aaBb Aabb aabb例子： 二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为 AAbb的纯合单株 单倍体方法： AAbb出现的概率为1/4。单倍体 供体亲本 AaBb 花培 二倍体AB------ --------------------& AABB aB----------------------------& aaBB Ab----------------------------& AAbb ab-- --------------------------& aabb3 植物花药/花粉培养历史? ?Guha和Maheshwari （1964） 曼陀罗花药培养Nitsch 和 Norreel (1973) 烟草花粉培养（游离小孢子培养） Chu（1973）小麦花粉培养（早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自 发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）?80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展。许多作物小孢 子培养已经成功。十字花科、麦类、水稻、玉米等。 90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相 续成功Konzak (1999) 。?4、花粉粒特点花粉粒：由两个细胞构成，一个是营养 细胞，一个是生殖细胞，生殖细胞被大的营 养细胞包围，营养细胞和生殖细胞各具有一 个细胞核。 花粉粒具有全能性：即具有生成一完整植 株能力。。生殖细胞 （内含细胞核） 营养细胞营养细胞核
?液泡单核晚期第一次有丝分裂后期?生殖核营养核? ?生殖核 双核早期 双核中期
处于不同发育时期的烟草小孢子四分体: 醋酸洋红染色单核期双核期四分体: Alexander’s 染色成熟花粉粒二、花药培养产生单倍体的潜在可能性花粉粒花粉粒 如何雄配子体孢子体（一）单核小孢子在发育途径上存在四种不同可能性1、单核小孢子进行一次不对称的有丝分裂，形成了一个小的生 殖细胞和一个大的营养细胞。 2、花粉胚囊 单核小孢子核连续3次分裂，形成一个类似8个核 胚囊（雌配子体）结构。 3、幼龄小孢子可能十分接近发育途径转变的临界点，在适宜条 件下，形成一个雄性起源的单倍体。 4、小孢子发育雄性配子体的潜力受到干扰和破坏，这是小孢子 就会通过不断分裂形成愈伤组织。(二)、雄核发育途径1、A途径生殖细胞（1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体 （2）A-G途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成营养细胞和（3）A-VG途径（E途径） 由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂， 共同形成单倍体（4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株2、B途径小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由这两细胞连续分裂形成单倍体植株，或者核融合 形成多倍体植株（二）花粉二型性指在一个花药中可以出现2中不同类型的花粉粒，一种 是正常的，一种是不正常的（E-花粉粒）或（S-花粉粒）。 （ E-花粉粒）或（S-花粉粒）在适宜条件下可以发育 成胚。――花粉发育途径的预成论。愈伤组织发育途径水稻花药培养接种在平板上的水稻花药部分花药产生愈伤组织水稻花药培养愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株胚状体发育途径芸苔属小孢子培养a) 球形胚d) 鱼雷形胚烟草花药培养通过胚状体途径再生形成小植株三、花药培养的一般程序1、取材 注意首先确定花粉发育时期；一般在单核后期花药对培 养反应较好。（一般用醋酸洋红压片检测） 2、预处理 一般多采用低温冷藏，显著提高花药的愈伤组织的诱导率。 （10℃以下，2周以内） 3、消毒 一般用70%酒精喷洒或擦试花器官。 4、接种 一要注意不要使花药受伤。二要注意“密度效应”。?? ??? ? ??5、培养方式和培养条件 花药培养方式： （1）是在琼脂固化培养基培养 （2）液体培养基表面漂浮培养 （3）利用固体-液体双层培养基培养 花药培养条件:适宜的温度 变化的光照? ?6、花粉植株的诱导（1）花药接种在无激素培养基上，直接形成胚状体。 如烟草花药的培养。? ?（2）不能直接形成胚状体，而要分步培养诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织（加2，4-D（1~3 J/L） ? 诱导单倍体愈伤组织分化形成植株（NAA和KT各 0.5 J/L） 7、壮苗和移栽 一般在植物长出2-3片叶的花粉植株转入含有NAA 和KT，LH和蔗糖等MS培养基。进行壮苗培养?四、影响雄核发育的因子雄核发育 指的是小孢子沿孢子体途径发育 成花粉植株的过程。 影响因子主要有： 1、基因型 是影响花药培养反应的重要因子。 2、生理状态 供体植株的年龄 3、花粉发育时期 一般单核后期对花药发育培养较好。例如 毛曼佗罗花药培养中花粉发育时期对花粉植株形 成的影响???? ? ? ??毛曼陀罗花药培养中花粉发育时期对花粉植株形成 的影响?花粉发育时期接种花药 产生小植 数 株的花药 数产生小 植株的 花药%四分体或幼龄小孢子 中期液泡化小孢子 核已完成DNA合成的小孢子 花粉第一次有丝分裂 双核早期液泡化营养细胞累积淀粉之前非液泡化花粉粒35 27 113 20 122 11613 17 96 19 84 1617 63 85 95 69 144、药壁因子在花粉发育过程中花药壁起着重要作用。只 有原来紧贴靠着花药壁的花粉粒，才能顺利发育 成花粉胚。 5、培养基 （1）基本培养基对花药培养的成败影响很大 一般采用MS，后来又设计出N6，C17，W14 （2）碳源 常用是蔗糖，其它象麦芽糖、果糖、 葡萄糖等作碳源。注意在一般选择原则：在不妨 碍花粉细胞的增殖，又能抑制体细胞的增殖的浓 度。（3）植物激素??不需要植物激素需要植物激素调节（4）活性炭一般在无激素的培养基上有促进花粉形成植株的频 率；但在无激素的培养基上可能添加对诱导植株形成有 害。五 雄核发育单倍体的个体发生过程?? ? ? ? ? ?1、花粉单倍体的诱导萌发（雄性配子 合成（精细内质网 雄花粉 启动 、大量核糖体） 花粉母细胞 囊泡化细胞 小孢子 结构重组 （稀薄的细胞质） 关闭 不萌发 静止状态 胚性花粉 （体积小染色体）???形成组织/胚（单倍体）2、雄核发育早期过程的4种途径Ⅰ途径 单核小细胞进行一次均等分裂，形成2个等同的子细 胞，而不是形成有区别的营养细胞和生殖细胞。 Ⅱ途径 单核小细胞进行一次正常的非均等分裂，然后经过营 养细胞的进一步分裂形成孢子体。生殖细胞不分裂或分裂 1-2次即退化。 Ⅲ途径 花粉胚主要有生殖细胞单独形成的，营养细胞或不分 裂，或分裂几次就停止。 Ⅳ途径 形成一个的营养细胞和一个生殖细胞，2个细胞都进 步分裂并参与孢子体形成。六、白化苗现象（一）白化苗产生的影响因素及机理1、内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、 花粉发育时期。2、外因 预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养 条件和方法、愈伤组织转分化时间等。 3、机理 核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生 白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。（二）白化苗的控制通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进 行调控。? ?? ??思考题 1 单核小孢子在发育途径上存在四种不 同可能性是什么？ 2 雄核发育途径有哪些（A、B途径）？ 3 单倍体培养的意义有哪些 ? 4 什么是单倍体？什么是药壁因子作用？第七章 原生质体的分离、培养和融合 一 概述1、概念：脱壁后的植物细胞称为原生质体（protoplast）， 在这里指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞 。 2、特点 ①比较容易摄取外来的物质，如DNA、细胞器、病毒、质粒等， 是进行遗传转化研究的理想受体； ②便于进行细胞融合，形成杂交细胞； ③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分 化成完整植株。二、原生质体的分离 1、机械法分离（1892年，Klercker)把细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞发生质壁分离， 原生质体收缩成球，然后用利刀切割。 缺点：产量极低；应用的材料受限制（如分生细胞和其它 液泡化程度不高的细胞）；操作极费力。2、酶法分离 （1960年，Cocking）可分为酶分步解离和混合酶解离两种。酶分步解离：先用果胶酶解离植物组织，接着用纤维素酶处理。 混合酶解离：利用两种酶混合解离，直接分离出原生质体。 酶法可在短时间内获得大量原生质体，克服了机械法分 离的缺陷，缺点是：不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能 有不同程度的毒害作用。显微镜下的原生质体三、影响原生质体分离的因素（酶法）1. 外植体来源: 生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原 生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈 伤组织形成乃至植株再生。 叶肉细胞是常用的材料，因为叶片很易获得而且能 充分供应。取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片。 另一个分离原生质体的常用材料是愈伤组织或悬浮 细胞，采用其作材料可以避免植株生长环境的不良影 响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理 时操作方便，无需消毒. 选用悬浮细胞作材料时，需每隔3-5天继代一次， 培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态。一般在继代 后的第三天游离原生质体。??2. 酶液组成和浓度 ： 植物细胞壁由三个主要成分构成 ： 纤维素，占壁干重的25-50% 半纤维素 ，平均53% 果胶质 ，5% 用来分离植物原生质体的酶制剂主要有纤维素酶、半 纤维素酶、果胶酶和离析酶等，酶解花粉母细胞和四分体 小孢子时还要加入蜗牛酶。 纤维素酶的作用是降解构成细胞壁的纤维素，果胶酶的作 用是降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开，以及 细胞与细胞分开 。??常用的酶制剂及其生产厂家有：酶 来源 生产厂家纤维素酶类 Cellulysin 绿色木酶 Calbiochem., San Diego,CA 92037, USA Onozuka R-10 绿色木酶 Yakult Honsha Co. Ltd.,Tokyo,Japan 果胶酶 Macerozyme R-10 根酶 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo,Japan Pectinase 黑曲酶 Sigma Chemical Co.,St,Louis,MO 63178, USA 半纤维素酶 Rhozyme Hp-150 黑曲酶 Rohm and Haas Co.,Philadelphia,PA19105, USAHemicellulase 黑曲酶 Sigma Chemical Co.,St,Louis,MO 63178, USA大多数植物分离原生质体时，纤维素酶浓度在1%-3%，果胶酶 在0.1%-1%，但也有很多例外。3. 渗透压：原生质体操作需要在一定渗透压存在下进行， 常用的配制分离原生质体酶液的溶液以及洗涤原 生质体的溶液为CPW液，CPW盐成分为： KH2PO4 27.2mg/L KNO3 101.0mg/L CaCl2.2H2O 1480.0mg/L MgSO4.7H2O 246.0mg/L KI 0.16mg/L CuSO4.5H2O 0.025mg/L pH 5.8根据渗透剂的浓度和成分可分为以下几种培养基: CPW13M: CPW盐+13%甘露醇(mannitol) CPW9M: CPW盐+9%甘露醇 CPW21S: CPW盐+21%sucrose CPW0M: CPW盐溶液。 多数情况下，甘露醇是常用的渗透剂，可能是由 于它的钝性及扩散入原生质体的速度很慢的缘故， 这样一来能保证一个稳定的渗透压。4. 分离培养基: 钙、镁离子很重要；有时需要激素；PVP有时 能增加原生质体产量。分离原生质体的培养基用量 一般为10mg/g组织。 5. 培养条件: 最主要的是酶处理时的温度和pH。 不同的酶需 要的pH值不一样，但pH大于6时不利于原生质体生 存。 一般而言，分离原生质体的培养时间与温度成反 比，可是高温下短时间分离的原生质体不适于培养， 他们易发褐和破裂。但酶处理时间一般不超过24小 时。一般常用温度是23-32℃。酶处理时一般在暗 处培养。叶片分离原生质体可在静置条件下进行， 悬浮细胞由于壁厚，培养（分离）过程中间断低速 震荡有利于酶渗透。四 原生质体的收集、纯化与活力测定 经酶解处理后，得到的混合物是一个由原生质体、 细胞团与细胞碎片等组成的混合液，只有将杂质和 酶液去掉，使原生质体纯化，才能进行培养。 1. 收集: 原生质体混合液用滤网(40-100? m)去掉没有降 解的细胞及组织，收集滤液。 2. 洗涤: 将网下物低速离心，去掉上清液，再加无酶液的 CPW液悬起原生质体，再离心，弃上清，重复几次 即可.3.纯化:采用上浮法和下沉法两种纯化方法。上浮法是将酶解的原生质体与蔗糖溶液（23%左 右）混合,离心后原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到底 部； 界面法 是先将原生质体与13%的甘露醇混合，然 后加到23%的蔗糖溶液顶部，形成一个界面。 两种方法中，均在100?g下离心5-10分钟，会在蔗糖 溶液顶部形成一条原生质体带。用吸管将带轻轻地吸 出来，用培养基悬浮离心，然后稀释到104-105/ml， 用于培养。4. 活力测定: 原生质体培养前通常要进行活力检查，以便知 道其状态是否正常。 测定原生质体活力的方法主要有观察胞质环流 （Cytoplasmic streaming）、测定呼吸强度和FDA 染色，其中最常用的是FDA法。 FDA是荧光素双醋酸酯 （Fluoresceindiacetate,FDA），常用丙酮配置成 2mg/ml溶液，在冰箱（4?C）中保存。 原理： FDA本身没有极性，无荧光，可以穿过细胞膜 自由出入细胞，在细胞中不能积累。在活细胞中， FDA经酯酶分解为荧光素，后者为具有荧光的极性 物质，不能自由出入细胞膜，从而在细胞中积累。 在紫外光照射下，发出绿色荧光。相反如果是死细 胞，则不会发出绿色荧光。?五、原生质体培养1.原生质体计数 原生质体培养前必须调到一定密度，即 确定每毫升培养基中含多少原生质体。用 CPW13M悬浮原生质体，血球计数板计数， 计算稀释倍数，离心，去除CPW13M，用 所算体积的培养基悬起原生质体，用于培 养。血球板放大后的计数室(40×)2.原生质体培养主要有三种方法: (1)液体浅层培养（Liquid thin layer culture） 原生质体纯化后，将原生质体悬浮于液体培养基 中,取少许于培养皿底部形成很薄的一层，封口进行 培养。 (2)固体培养（Solid culture） 也叫琼脂糖平板法（Agarose plate culture）或包 埋培养法（Embedding culture）。将原生质体悬浮 于液体培养基后，与凝固剂（主要是琼脂或低熔点 琼脂糖，LMT agarose）按一定比例混合，在培养 皿底部形成一薄层，凝固后封口培养。(3)固液双层培养法（Solid over liquid culture）此法结合液体浅层培养和固体培养的优点，在培 养皿底部先铺一层固体培养基，待凝固后再在其上 进行液体浅层培养。固体培养基中的营养成分可以 被液体层中的原生质体吸收利用，而原生质体产生 的有毒物质可以被固体培养基吸收。植板率（Plating efficiency）即形成愈伤 组织的原生质体数量占所培养原生质体总数 的百分比）3.细胞再生(1)细胞壁的形成原生质体培养后经过一段时间会再生出细胞壁， 原生质体在培养初期仍然为圆球形，随着培养时间 的延长，逐渐变为椭圆形，此时表明已经开始再生 细胞壁。 不同植物原生质体培养再生细胞壁所需时间不一 样，从几小时到几天。 简单的鉴别壁的再生的方法是用荧光增白剂 （Calcofouor White)，专染纤维素，在荧光灯下发 出荧光。一些因素影响壁的再生：①碳源；②培养 条件――固体培养时细胞壁再生比液体培养时快； ③渗透剂的种类。 (2)细胞分裂 第一次分裂通常发生在培养后2-5天，可在黑麦 中需14天。植物原生质体培养过程 简 图4.植株再生具有再生能力的原生质体就会不断分裂， 形成多细胞团。当细胞团进一步发育成为肉 眼可见的小愈伤组织（Minicallus），要及时 转移到分化培养基（Differentiation medium） 中 ，培养与再生过程同一般的愈伤组织培养。六 原生质体融合(一) 原生质体融合的概念和意义 1、概念: 是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件 下融合创造杂种的过程。为了与有性杂交区别开来，原生质 体融合常常写作“a（+）b”，其中a和b是两个融合亲本， （+）表示体细胞杂交。原生质体融合（Protoplast fusion），即细胞融合（Cell fusion），也叫体细胞杂交（Somatic hybridization），超性 杂交（Parasexual hybridization）或超性融合（Parasexual fusion(1)植物体细胞杂交过程 示意图(2)(3)(1) (5)(4)2、原生质体融合的意义（1）、克服有性杂交不亲和和生殖障碍 一些植物的野生材料具有很好的抗性，但与栽培 品种之间存在有性杂交不亲和现象，难以通过常规 技术实现有益抗性的转移。原生质体融合不涉及到 雌雄性配子，从而可以克服生殖障碍。 在二十世纪八十年代，有学者试图将番茄和马铃 薯的原生质体融合。2）、转移有利的农艺性状，创造新的种质材料 作物栽培品种常常缺乏某些抗性性状，在栽培中处于不利 地位。野生种中具有很多优良的抗性，通过原生质体融合可 以将野生种的抗性转移进栽培种中。药用植物也可以进行这 方面探索。 （3）、转移胞质基因，为研究体细胞遗传提供途径和材料 现有研究表明，植物的细胞质控制着很多优良的性状，如 线粒体控制胞质雄性不育，叶绿体控制的抗除草剂特性。由 于有性杂交的胞质成分主要为母系遗传，不可能实现杂交亲 本的胞质杂交。但原生质体融合则可以达到此目的。（二）原生质体融合方法 1.自发融合（Spontaneous fusion ）自发融合即酶解细胞壁过程中，有些相邻的原生质体彼 此融合形成同核体。来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发 融合的频率较高。小孢子来源的原生质体融合率可高达 50%-70%。实际上自然条件下受精就是一种自发融合。2. 诱发融合主要诱发融合方式高pH-高钙法 水溶性多聚体（PEG）法 电融合法 NaNO3法Kuster在1909年就观察到低渗NaNO3溶液能 引起发生质壁分离的洋葱表皮细胞原生质体融合 。 Power于1970年采用0.25M NaNO3溶液诱导燕 麦与玉米根尖原生质体融合，首次得到融合体。 1972年，美国学者Carlson等采用此法获得了 朗氏烟草与粉蓝烟草体细胞杂种，这是植物中的 首例体细胞杂种。 这种方法一般不再用，其严重 的缺陷就是融合频率低，而且对于来源于叶肉的 高度液泡化的原生质体有害。这种融合的机制一 般认为是Na+造成了膜电位的改变。高pH-高钙法Keller和Melchers于1973年报道采用含高浓度 Ca2+的强碱溶液（0.05M CaCl2.2H2O+0.4M甘露醇， pH10.5）处理烟草叶肉原生质体，可以使融合频率 较大幅度增加，达到50%。 之后，采用此方法成功地获得了烟草种间和属 间体细胞杂种。PEG法PEG是聚乙二醇（Polyethylene glycol），是一 种水溶性的高分子多聚体。是诱导原生质体融合最为 常用的化学试剂 。 1976年Kao发现用含高浓度Ca2+的强碱溶液 （0.05M CaCl2.2H2O，pH为9或10）清洗PEG诱导后 的原生质体时，融合频率得到进一步提高，因而,发 展起高钙高pH-PEG法。PEG诱导融合的可能机制是：由于PEG带有阴电荷的醚键，与带阴电荷 的原生质体相遇后，在Ca2+离子作用下形成共 同的静电荷，从而促进异源原生质体的粘着和 接合，当用高Ca2+高pH溶液清洗后， Ca2+和 PEG被洗掉，打破电荷平衡，使原生质体的某 些阳电荷与另外一些原生质体的阴电荷连接起 来，形成具有共同质膜的融合体。 一般PEG的分子量为，常用的 PEG分子量为和6000。最终浓度为 25%-50%。电融合（Electrofusion）主要是双向电泳法，其基本原理是：原生质体 放置于有低电导率融合液的融合小室（Fusion chamber）中，小室的两极加有高频、不均匀的交 流电场（Alternating current，AC），电场发生的 双向电泳和电场产生的力作用于原生质体，原生质 体两极的电场强度不一致使其表面电荷偶极化而具 有偶极子的性质，从而使得原生质体沿电场线运动， 相互接触排列成珍珠串（Pearl chain）。当施加一次或多次直流方波脉冲电场（Direct square wave current），相接触的原生质体发生 可逆性击穿，最终导致融合。整个融合过程大致可 以划分为以下几个阶段：原生质体接触，质膜融合， 圆球化，核融合 电融合是目前最常用的方法，因为它避免了 化学物质的潜在毒害。融合率与原生质体来源、体 积、链的长度、脉冲持续时间及电压等因素有关。-+ ++-+ +--+-+ +-+ +-+ ++-原生质体在双向电泳中形成串（三）原生质体融合方式 对称融合（Symmetric fusion） 非对称融合（Asymmetric fusion) 配子-体细胞融合（Gameto-somatic fusion) 亚原生质体-原生质体（Subprotoplastprotoplast fusion） 1、对称融合 是亲本原生质体在融合前未进行任何处理（如辐 射、碘乙酰胺等）的一种融合方式。 特点 由于它综合双亲的全部性状，在导入有利性 状的同时，也不可避免地带入了一些不利性状。2、非对称融合在融合前，对一方原生质体进行射线照射处 理，以钝化其细胞核，另一方原生质体不处理或经 化学试剂（如碘乙酰胺、碘乙酸、罗丹明6-G等） 处理，前者通常称为供体（Donor），后者则称为 受体（Recipient），所以也称供-受体融合 （Donor-recipient fusion）供体处理 对供体进行处理的目的主要是造成染色体的断裂 和片段化（Fragmentation），从而使供体染色体进 入到受体后部分或全部丢失，达到转移部分遗传物 质或只转移细胞质的目的。 对供体的处理有以下几种方法： 射线（X、γ和UV）辐射原生质体； 限制性内切酶处理原生质体； 纺锤体毒素、染色体浓缩剂处理原生质体。 但从几种方法对原生质体的效果来看，射线的作 用最好。绝大部分情况下，被辐射的供体材料为原 生质体。原生质体辐射后，用洗液洗1-2次就可以用 于融合。（2）受体的处理为了减少融合再生后代的筛选工作，研究者利 用一些代谢抑制剂（Metabolism inhibitor）处理受 体原生质体以抑制其分裂。常用的抑制剂有碘乙酸 （Iodoacetic acid，IA）、碘乙酰胺 （Iodoacetamide，IOA）和罗丹明6-G （Rhodamin 6-G，R-6-G）。受IA、R-6-G和IOA处 理的细胞和未受代谢抑制剂处理的细胞发生融合后， 代谢上就会得到互补，从而能够正常地生长。配子-体细胞融合主要应用于三倍体生产 亚原生质体-原生质体融合 亚原生质体主要有小原生质体 （Miniprotoplast，具备完整细胞核但只含部 分细胞质）、胞质体（Cytoplast，无细胞核， 只有细胞质）和微小原生质体 三种类型。这种 融合方式主要用于获得高度不对称杂种。（四） 融合产物 对称融合和非对称融合再生的体细胞杂种均能够 获得对称杂种、非对称杂种和胞质杂种三种情况。 1、对称杂种（Symmetric hybrid）指杂种中具有融合双 亲全部的核遗传物质， 2、非对称杂种（Symmetric hybrid）指双亲或其中一方 的核遗传物质出现了丢失。 3、胞质杂种（Cybrid）是非对称杂种的一种，指融合一 方的核物质完全丢失，并且具有双方的细胞质遗传物 质。 还有一类杂种叫异质杂种（Alloplasmichybrid）， 指杂种的细胞核来源于一方，而细胞质来自于另一方。（五）体细胞杂种的筛选和鉴定1.体细胞杂种的筛选 在融合群体中，含有异源融合子（Fusant）、同源融合子、 未融合的原生质体。因此需要采用一定的选择方式获得异源 融合子。 机械选择法 主要利用融合亲本的物理特性差异进行筛选，如在叶肉 原生质体和愈伤组织原生质体融合中前者含有叶绿体呈绿色， 后者含有很多淀粉粒和浓厚的细胞质，在倒置显微镜下可以 根据颜色将融合子挑选出来 互补选择法 生长互补筛选法 ：此法是根据融合双亲原生质体及其同 源融合融合体和杂种细胞对培养基中外源激素需求性的差异， 淘汰双亲原生质体和同源融合体，保留杂种细胞以达到选择 的目的。 营养缺陷型互补筛选法 白化突变体和隐性非等位基因互补筛选法 抗生素的抗性互补性差异筛选法2.体细胞杂种的鉴定在融合再生植株中既有亲本类型植株，也 有体细胞杂种，因而只有进行鉴定才能确定 是否是真的体细胞杂种 形态学 细胞学 鉴定方法 遗传标记 3. 体细胞杂种在育种和遗传研究中的应用 创造属间、科间杂种（如玉米、小麦融合， C4向C3转移） 转移抗病性 研究双受精过程? ? ? ? ?1 2 3 4 5什么是原生质体培养？ 原生质体有哪些特性？ 如何分离获得原生质体？ 原生质体融合（细胞杂交）？ 原生质体融合的意义是什么？第八章 植物细胞培养及应用Plants Cell suspension Artificial seeds Mutation selectIsolation protoplasts一、概述 Secondary products 20世纪初，开始尝试。目前研究很活跃，可以培养单个细胞 和产生完整的植株。? ?二、单细胞的分离1、完整的植物器官分离单细胞（1）机械法将10g叶子 纱布过虑 40ml 研磨培养基研磨 细 收集分离的细胞 离心和 洗涤研磨培养基：20 mmol/L蔗糖，10 mmol/L MgCl2、20 mmol/L tris-HCl缓冲液，PH=7.8（2）酶解法 （1968年，Takebe 和他同事用果胶酶处理烟草 叶组织）培养植株 叶片表面消毒 撕下下表皮 锥形瓶（含酶液） 抽滤 振荡（25℃） 切割4M2 放入 洗涤 植板培养皿?酶液组成：0.5%离析酶、 0.8%甘露醇、1%的葡聚糖硫酸 钾。?2 由培养组织中分离单细胞 愈伤组织2g 25 ℃±1 ℃ 振荡培养 10天培养基 物 变清 继代培养更换 建立悬浮培养振荡的作用：1、对细胞团施加缓冲压力 2、使细胞和小细胞团在培养基中保持均匀分布 3、促进容器中气体交换??三 悬浮培养1、概念 指的是一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的培养系统。 2、培养类型 （1）分批培养 是指把细胞分散在一定容积培养基中进行培养，目 的是建立细胞悬浮培养物。 要求：容器是密闭的；及时进行继代培养；稀释5倍。 细胞数目增长S曲线（滞后期、指数生长期、直线生长期、减慢期、 静止期）??? ?细 胞 数 目?时间
（2）连续培养通过加入新鲜培养基和排出使用后的培养基在特殊设计 的大容量培养容器中长期大规模、稳定地培养细胞，这种培 养方式称连续培养或大量培养。 可以分为封闭式和开放式连续培养。 开放式连续培养：注入的新鲜培养液的容积与流出的原有 培养液及其中细胞的容积相等，并通过调节流入和流出的速 度，使培养物的生长速度保持在一个接近最高值的恒定水平 上。 封闭式连续培养：排出目的培养基由加入的新鲜培养液 进行补充，进出数量保持平衡。悬浮在排出液中的细胞经机 械方法收集之后，又被放到培养系统中。随着时间延长，细 胞数目不断增加。???3、由悬浮细胞再生植株（1）由悬浮细胞直接形成体细胞胚 （2）由悬浮细胞在半固体培养基上培养诱导形成 愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株。 4、细胞悬浮培养的培养基?? ?? ? ?（1）悬浮培养对培养基的要求注意生长素和细胞分裂素的比例 增补维生素和水解蛋白 无机磷酸盐的消耗问题 常选择B5和ER两种培养基（2）培养基的振荡振荡的作用： 1、 使愈伤组织破碎成小细胞团和单细胞 2、使细胞和小细胞团均匀分布在培养基中 3、促进容器中气体交换 振荡的速度： 水平往复式摇床：转速60-150 r/min 旋转式摇床：转速1-2 r/min?5、悬浮培养细胞的同步化同步化培养是大多数细胞同时通过细胞周期每 个阶段（G1、S、G2和M）的培养方法。可以用细 胞同步百分率来表示。有两种方法：物理方法和 化学方法。 （1）物理方法 按体积选择：按细胞团大小为标准，选择细胞 团，来获得同步化生长的细胞。一般采用31微米 直径筛过滤。 热击：低温冲击与营养饥饿想结合能诱导悬浮 培养物的同步化。100ml新鲜培养加入10ml培养细胞 摇床培养 （27℃ ) 冷藏静止3天 加入10倍27℃新鲜培养液 培养24小时 重复处理3天? ?（2）化学方法使细胞停止在G1或G2，经过一段时期饥饿之后，当重新在培养基中加 入这种限制因子，静止细胞就会同步进入分裂。饥饿法：先对细胞供应一种进行细胞分裂所必须的营养成分或激素，?抑制处理 ：利用生物化学抑制剂暂时阻碍细胞周期循环，使细胞分裂积累在某一特殊时期，达到细胞生长同步化。?6、单细胞培养 从植物器官或细胞悬浮培养物分离的游离细胞，作为单 细胞在离体条件下用适当的培养基培养的方法。（1） 平板培养法 先将含有游离细胞和细胞团的悬浮培养物过滤，留下游离细胞和小 细胞团。进行细胞计数，根据实际情况，使悬浮培养液达到最终所要求 的植板细胞密度的2倍。把它加入到0.6~1%琼脂的培养基加热，使琼 脂融化，然后冷却到35 ℃，置于恒温水浴中，将悬浮培养液和这种培 养基等量混合，迅速注入到培养皿中铺展。然后封口培养观察，记下单 个细胞。可以分离出纯单细胞无性系。 培养方法和原生质培养相同。 （2）看护培养? ???
?7、细胞培养的应用（1）植物细胞工程工业植物细胞生产 是细胞生物量的增长，为重要的产品之一。如人参10K/天，紫草 细胞培养750L的规模。日本的烟草细胞培养63g/L，达到20L的规模。??天然化合物的生产目前植物细胞培养的有用物质有400多种，其中包括色素、生物碱、 维生素、多糖，植物杀虫剂。应用前景广阔。?生物转化利用植物培养细胞为酶源，使某种前体化合物生产相应产物的技术， 称为生物转化。 如在紫草细胞培养，添加L-苯丙氨酸，使紫草素的产量增加3倍。?（2）植物细胞工程广泛采用组织培养技术进行繁殖 现在有100多种植物获得 了再生植株。 利用细胞培养适应性变异筛选出新品种 利用细胞融合技术培养出杂种植物。?? ?? ? ?1 什么是细胞培养？ 2 、细胞培养应用哪些方面（5个方向）？ 3、什么是细胞悬浮培养？第九章 植物脱毒技术第一节 植物脱毒原理与方法 一、概述植物中有通过营养繁殖的，药用植物也有这样的繁殖 方式，如菊花、苍术、金银花等。常常产生病原菌的侵染。 严重影响产量和质量，而通常又无法采用药剂灭菌。因此， 根除病毒是有必要的。病毒在植株分布存在不均匀现象一般顶端分生组织无病毒或病毒浓度很低。为什么会存在这种 现象？1、在植株体内，病毒易于通过微管系统而移动，在细胞间是 通过胞间连丝，但速度很慢，很难追上生长点的茎尖。 2、 在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很高，使病毒无法 进行复制。 3、在植物分生组织中应比任何其他区域更容易“钝化”病毒。 4、在茎尖中存在高水平内源生长源，可以抑制病毒生长。第9章 植物脱毒技术二 培育无病毒苗的意义：1 意义 用组织培养方法生产无毒苗，可减少病毒危害， 提高产}