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EML4/ALK融合基因检测探针
本试剂盒主要用于非小细胞肺癌（）的融合基因的检测，里面包括即用型杂交液和DAPI复染剂。
包装规格：5人份/盒，10人份/盒，20人份/盒。
适用样本类型：中性福尔马林固定石蜡包埋的组织样本切片
预期用途：
&&&&近年来发现所形成的融合基因EML4-ALK是非小细胞肺癌(中的一种分子亚型，是靶向药物克唑替尼的作用靶标。在一般人群中阳性率很低，约为3%-7%。此种亚型的患者较年轻、男性比例高、不吸烟或仅少量吸烟的可能性较大、组织学检查常为腺癌；且在有肿瘤转移的患者中，阳性与耐药相关，似乎不影响铂类为主联合化疗的疗效。阳性群体和阴性群体的缓解率相似，并且总生存也无显著差异。但是，阳性患者只存在于基因没有发生扩增或点突变的患者中。当肺癌患者基因没有发生异常时，可考虑对其进行检测，以考虑是否应用靶向药物克唑替尼。
&&&&和基因有多个断裂位点，用方法检测可排除其断裂位点多态性的影响。并且，本试剂盒设计为三色探针（绿青红），可排除双色探针固有的由于与位置相近而导致的假阳性或假阴性结果。
&&&&本试剂盒仅供科研使用。alk_百度百科
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ALK最早是在间变性大细胞淋巴瘤（ALCL)的一个亚型中被发现的，因此定名为间变性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase，ALK）。随后，在发现非小细胞肺癌中有ALK基因重排之前，在弥漫性大B细胞淋巴瘤和炎症性肌纤维母细胞瘤（IMT）中分别发现了有多种类型的ALK基因重排，至此证明ALK是强力致癌驱动基因。
ALK基因全长ALKcDNA含有29个外显子。全长ALK蛋白含有1620个氨基酸，预计分子量为177千道尔顿
ALK的人体组织Northern（RNA）印迹分析
（kDa）。254个氨基酸激酶结构域由位氨基酸残基组成，在此之前是一个由氨基酸组成的短跨膜区。
在小鼠体内的表达形式提示其在中枢和以及外周神经系统的发育中起作用[1]
；在果蝇中发现ALK 以配体结合的形式促进肠管肌肉组织形成，哺乳动物配体尚未确定；人类视网膜中检测到ALK 蛋白质。
alkALK的发现
EML4-ALK融合出现在大约3-5%的非小细胞肺癌中，具体因研究的人群和使用的ALK检测方法的不同而有所差别。
alk非小细胞肺癌中唯一驱动突变
2007年两个独立研究小组在非小细胞肺癌中分别鉴定出ALK基因重排。
其中一组研究人员开发了逆转录病毒cDNA表达库用于筛选新癌基因。他们转染了提取自一位预先筛选显示KRAS和EGFR突变阴性的62岁日本男性吸烟者肺腺癌的cDNA文库，并设计生成了转基因小鼠，在肺泡细胞中特异性表达EML4-ALK，由此生成了许多肺腺癌结节。使用ALK抑制剂治疗这些转基因小鼠导致肿瘤负荷相比于未治疗的小鼠减小。大部分小鼠很快在1个月内死亡。使用相同ALK抑制剂治疗导致肺脏无EML4-ALK/3T3细胞浸润且生存期延长。此研究有力证实了EML4-ALK是非小细胞肺癌中唯一的驱动突变，并且在体内抑制EML4-ALK活性会导致肺癌负荷减少[2]
ALK融合基因的产物是分子量为80 kD的融合肿瘤蛋白，其转化细胞的能力已得到公认。P80NPM-ALK通过使大鼠纤维母细胞发生锚非依赖性（anchorage independent）生长，增殖率明显增高；此外，它还可使Ba/F3细胞转变为IL?3非依赖性。通过逆转录病毒将NPM-ALK转染小鼠骨髓细胞，这些小鼠随之发生了T细胞和B细胞性大细胞淋巴瘤。
尽管因npm的独特功能P80NPM-ALK在细胞核内有集聚现象，但NPM对于ALK的转化作用并不是必需的，因为有研究发现：其他基因与ALK基因发生融合，也可激活ALK，虽然这些肿瘤蛋白未在核内集聚，仍可使细胞发生恶性转化。这一发现与临床上一些现象完全吻合：多种涉及ALK基因的染色体易位，均可引起ALK的结构性活化而引起ALCL。故这一组疾病又被称为ALK阳性淋巴瘤或ALKoma
鉴定非小细胞肺癌中的“驱动激酶”
同时，另一组研究人员采用磷酸化蛋白质组学方法，确定了191个非小细胞肺癌细胞系，和肿瘤样本中磷酸化酪氨酸的特点，从而鉴定出ALK是非小细胞肺癌中的“驱动激酶”。
因此，两组研究分别采用两种不同方法确定了ALK易位，这在常见恶性实体瘤中尚属首次。
alk流行病学数据
美国肺癌突变联盟报告称在901例患者中，采用ALK分离检测时， ALK阳性占8.3%的腺癌（较年轻，女性和从不吸烟者较多）。此外，研究人员采用包含9种已知的EML4-ALK融合转录物，和ALK RNA水平的多重逆转录聚合酶链反应，检测大规模筛选4500例非小细胞肺癌患者福尔马林固定石蜡包埋组织后，报告了3.2%的ALK阳性率。
回顾性组织库研究显示，ALK基因重排非小细胞肺癌的发生约占非小细胞肺癌的3%-5%，不同种族的发生率无明显差异。ALK基因重排非小细胞肺癌患者往往是年轻人（确诊时大约50岁），和从不吸烟者（约70%-75%），或少量吸烟者。绝大多数表现为腺癌，且无性别倾向。与有EGFR突变的患者相比，ALK阳性患者确诊时中位年龄较为年轻（分别为61和57岁），从未吸烟者或少量吸烟者所占比例较高（一生&100支香烟；48%对比67%）。
ALK阳性非小细胞肺癌的流行病学正在不断进展，并且未来的比较性研究应控制可能影响预后的临床和患者特征。
alk检测方法
alk荧光原位杂交（FISH）
ALK分离荧光原位杂交检测，是ALK诊断检测最终获得FDA批准，用于检测ALK基因重排非小细胞肺癌，连同克唑替尼(TM)获得美国批准的基础，也是目前唯一经临床验证的ALK检测方法。该检测可对FFPE组织进行，这也是绝大多数肺癌组织的处理方式。此外，要进行分离荧光原位杂交没有必要知道特定融合伴侣，因此，标准分离荧光原位杂交方案将允许在非小细胞肺癌以外检测ALK基因重排。
靶向治疗主要依赖于可发现有问题分子变化的经验证的检测，特别是当分子变化构成一小亚组患者时。理想情况下，检测应是高度灵敏和特异的，成本相对较低且在大部分诊断实验室中可行。荧光原位杂交在肿瘤中常规用于检测在软组织和血液系统恶性肿瘤中发挥了重要作用的染色体易位，包括ALK阳性ALCL诊断。
alk免疫组织化学法（IHC）
虽然荧光原位杂交法目前被认为是诊断ALK阳性非小细胞肺癌的标准，但免疫组织化学法有希望作为一种快速经济的方法成为全球病理实验室常规筛选和诊断的首选。类似于荧光原位杂交，IHC需要从FFPE组织块切取一张未染色的切片，只要至少含有一些存活的肿瘤细胞群[3]
。IHC可成功检测各种不同肿瘤标本，包括FNA细胞块。免疫组织化学法的主要挑战是在ALK基因重排非小细胞肺癌中ALK融合蛋白表达水平低。这最有可能是由于在ALCL的NPM-ALK蛋白生成中，EML4启动子相比于核磷蛋白启动子转录活性较弱。D5F3是一种很有前景的用于检测非小细胞肺癌中ALK基因重排的兔单克隆ALK抗体，在最新报告中显示有较高的灵敏度和特异性。
alkALK阳性
　　来自CAP、国际肺癌研究协会，和分子病理学协会的当前草案版本指南建议，在所有表现有腺癌成份的非小细胞肺癌患者中进行ALK检测，不论年龄、种族、性别和吸烟史如何。由专家意见小组制定的当前国家综合癌症网络指南建议反映，对没有具体指明EGFR突变和ALK基因重排的所有腺癌、大细胞和非小细胞肺癌患者进行的检测，并对检测结果符合患者采取靶向治疗。
．PDF[引用日期]
Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. ．Identifi cation of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. ：Nature，2007：448
Mino-Kenudson M,Chirieac LR,Law K et al.．A novel,highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. ． ：Clin Cancer Res ，2010　　摘要：随着靶向药物与个体化治疗的发展与广泛应用，肿瘤治疗已经进入到分子靶向治疗的时代。现代分子诊断技术的靶点检测是分子" />
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EML4—ALK融合基因检测在实际工作中应用的体会
　　摘要：随着靶向药物与个体化治疗的发展与广泛应用，肿瘤治疗已经进入到分子靶向治疗的时代。现代分子诊断技术的靶点检测是分子靶向治疗的前提，EML4-ALK融合基因发现主要表达于非小细胞肺腺癌中，利用高灵敏度和特异性的检测系统，将有助于筛选EML4-ALK融合基因阳性非小细胞肺癌患者。 中国论文网 /1/view-4608974.htm　　关键词：EML4-ALK 融合基因 非小细胞肺癌 靶向治疗 　　肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占80%.EML4-ALK融合基因被发现存在于部分非小细胞肺癌中。该融合基因常见于不吸烟的肺腺癌患者，有其独特的病理学特征，可以诱导肿瘤生成。ALK抑制剂能够作用于该基因的下游信号传导通路并拮抗其促肿瘤生成活性。近年来靶向治疗药物对特定基因型的非小细胞肺癌患者有明显的治疗作用，因此，有效的筛选出EML4-ALK融合基因阳性NSCLC是指导患者治疗的关键。 　　目前，利用患者的组织标本检测EML4-ALK融合基因的方法，常用的有荧光原位杂交技术（FISH），RT-PCR技术，免疫组化（IHC）及cDNA末端快速扩增技术均可检测EML4-ALK融合基因， 哪种检测方法更快捷、灵敏度和特异性更高成为了大家面临的新问题。现对我院开展的常用EML4-ALK融合基因检测方法进行比较如下： 　　1. RT-PCR检测：在非小细胞肺癌的病例中，多种EMLA-ALK融合基因的突变体己经被发现，多数是由于EML4基因的断裂点不同导致，因此精确诊断EML4-ALK阳性肿瘤需要检测EML4基因和ALK基因cDNA的所有融合方式，现已发现并确认至少9种EML4-ALK融合基因的突变体，在目前已知EML4-ALK融合转录突变体的基础上，采用三条引物组成的多重RT-PCR技术检测目前已知的多种突变体。且由于EML4-ALK为倒位融合，野生型组织细胞采用该RT-PCR不会产生扩增条带。该方法基于PCR技术，敏感且特异性好，粗略明确EMLA-ALK融合突变体。但也存在一些不足，对于潜在的非EML4基因与EML4-ALK融合则不能被检测到，而且对于潜在的EML的第21个外显子与ALK融合的转录突变体长度达1284bp，可能难于检测到。而且在实际工作中，对于一些肺部穿刺的活检标本因为量太少而无法检测。 　　2.荧光原位杂交（FISH）检测：该技术可以从病理切片或细胞涂片上检测少数细胞的融合变异。FISH方法具有高度灵敏度和特异性及高度重复性和可靠性，但探针的价格高，而且有限的探针片段有时会降低其敏感性，与其他实验技术一样也受到一些因素的影响，如标本固定时间过长，烤片温度过高，蛋白消化不当，变性的温度差异等，都会使信号减弱或无信号。且荧光原位杂交在评估染色结果时有一定的技术难度。 　　3. 免疫组化检测：可检测肿瘤特异性抗原的表达，但传统免疫组化试剂灵敏度较低，易出现假阴性结果。新推出的抗ALK（D5F3）兔单克隆抗体在试剂盒中使用增强DAB染色液和增强扩增试剂，使检测结果的灵敏度和特异性都明显提高 　　3.1 抗体类型：Mino-Kenudson等针对ALK融合基因的新型抗体（美国细胞信号转导技术公司的兔单克隆抗人CD246抗体克隆号：D5F3 或D9E4）采用免疫组化法筛查来自临床的石蜡标本并通PCR和荧光原位杂交技术等检测方法进行验证结果显示，与传统检测淋巴瘤ALK表达的小鼠来源标准抗体（克隆号：5A4）相比灵敏度和特异性均有明显提高。 　　3.2 检测组织的来源：手术切除的组织、针吸活检组织、支气管镜活检组织以及来自于细针穿刺物。标本及时用10%中性福尔马林固定，经梯度酒精脱水，二甲苯透明和浸蜡后，石蜡包埋成蜡块。 　　3.3 检测方法：切取3μm石蜡切片，60℃烤片过夜，脱蜡至水，利用罗氏诊断的抗ALK（D5F3） 兔单克隆抗体免疫组化检测试剂盒。该检测需要一套组织切片用于H&E染色，第二套组织切片用于抗ALK（D5F3）兔单克隆抗体染色，以及第三套组织切片用于兔单克隆阴性的质控抗体。试剂盒中使用增强DAB染色液和增强扩增试剂，并在VENTANA BenchMark XT/GX平台上完成染色。 　　3.4 质量控制：用一例已知ALK 阳性的非小细胞肺癌病例和一例ALK阴性的非小细胞肺癌病例可作为系统水平的质控，以确保染色仪器系统和相关检测试剂的性能合乎要求。 　　4.小结 　　EML4-ALK融合基因作为NSCLC的一个新亚型，其临床意义正逐渐体现，通过研制开发EML4-ALK融合基因检测试剂，对指导临床用药、降低临床检测成本将产生积极意义。针对ALK的靶向治疗将促使肺癌个体化治疗更加精准有效和逐步走向成熟完善。与此同时，对EMI4-ALK融合基因的检测方法也将逐步实现标准化。 　　参考文献： 　　[1]Jemal A， Bray F， Center MM， et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin， 2011， 61（2）： 69-90. 　　[2]Summary review （application number： 202570Orig1s000） Silver Spring： Food and Drug Administration， 2011. 　　[3]姚国栋侯明星袁宏伟等.荧光原位杂交与免疫组化法检测乳腺癌HER2表达的临床意义[J].肿瘤学杂志）：306-308. 　　[4]Jokoji R， et al. Combination of morphological feature analysis and immunohistochemistry is useful for screening of EML4-ALK-positive lung adenocarcinoma. J Clin Pathol. 66-77 　　[5]Mino-Kenudson M， et al. A novel， highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clin Cancer Res. 61-71 　　[6]MinoKenudson MChirieac LRLaw Ket al. A novel highly sensitive antibody allows for theroutine detection of ALKrearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemist[J].Clin Cancer Res ）：.
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