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【求助】用10%的SDS-PAGE跑10KD的蛋白有什么后果
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这个帖子发布于8年零29天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
书上10KD的蛋白都推荐用15%-20%的胶，否则蛋白会分不开我始终无法理解这个分不开是什么意思，按说我加了抗体只会出现我要的目的条带啊因为试了几次都发现15%胶跑Marker10KD的带会很模糊，而10%分的很清楚，10KD 的带都很漂亮，那我不能用10%胶上的Marker为准吗？菜鸟求解！
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关于分不开：简单说来，不同浓度的SDS-PAGE凝胶有不同大小的孔径，而大浓度的胶（如15%）孔径小，10KDa的蛋白为何推荐用15%的胶是因为该浓度胶能较好地匹配该分子量，因为小分子量的蛋白在较小浓度的胶（如8%等）中不能被捕捉到。 针对你的问题，你选择10%的胶的孔径与分子量不够匹配，另外我们在做10%胶时10KDa的marker通常是不容易跑出来的，所以检测蛋白时还是应该根据分子量的大小选择合适浓度的胶.
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那为什么我用15%胶的时候反而10KD的带出不来呢，在10%时却能出来不解啊
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难道是我电泳的条件不对？我是用70/120V，一共跑了1h 40min，Marker还是挤在一起没怎么分开，10KD带很模糊成一片是不是应该用低电压跑，时间久一点？那样会不会小分子量的蛋白弥散的更严重呢？
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关于丁香园请问：关于从PAGE胶中回收蛋白的问题 - 实验交流 - 生物秀
标题: 请问：关于从PAGE胶中回收蛋白的问题
摘要: [请问：关于从PAGE胶中回收蛋白的问题] 我想直接从SDS-PAGE胶中将我的蛋白切胶，经过透析从胶中回收回来，但是不知道透析电泳的时候缓冲液还用的是跑蛋白的Tris-Gly缓冲液么？我看有写的是1*SDS缓冲液，没配方，不知道是不是一种？？？ 关键词:[缓冲液 透析 SDS-PAGE 电泳]……
我想直接从SDS-PAGE胶中将我的蛋白切胶，经过透析从胶中回收回来，但是不知道透析电泳的时候缓冲液还用的是跑蛋白的Tris-Gly缓冲液么？我看有写的是1*SDS缓冲液，没配方，不知道是不是一种？？？
我们的步骤是切胶后，捣碎用PBS缓冲液溶解，离心，透析，再冷冻干燥。
我用的就是Tris-Gly缓冲液5000ml 配方：不调pH15.1g Tris-base94g gly50ml 10%(v/v) SDS
我用的也是Tris-Gly缓冲液建议LZ跑大胶再切胶回收 大胶一次可上2~3ml的样
1、一般是先跑小板胶，看看目的条带在那里，然后再跑大板的胶（没有Marker），把目的条带切下来，然后KCL染色，确实是白色的，切下来，切碎（象切菜），然后装在处理好的透析袋里，电洗脱，一般要注意用冰使洗脱液温度不能太高，要不然蛋白变性，也没有办法制抗体了。一般几个小时以后，看看透析袋里的胶是不是透明了，如果透明了，就把透析袋里的液体吸出来，然后离心，目的是把不小心吸上的小块胶出去，把上清测浓度，如果浓度不够，浓缩，然后再跑个小板胶，看看有没有其他杂带！一般要先过一下柱子，尽量减少杂带，这样大板胶也比较好切 2、电泳结束后把胶从玻璃板卸下，浸入0.3mol/LCucl2中负染十分钟，染色结束后蛋白带为透明的，移出并回收染液。将目的带用刀片小心切下放进一干净小烧杯，加入脱色液（0.25mol/LEDTANa2和0.25mol/LTriscl,PH为8.0）55摄氏度脱色，其间更换脱色液三四次，直至蛋白带为无色透明，再用ddH2O漂洗几次。置研钵中加入少量PBS溶液研磨，后转移入十字匀浆器中继续研磨，待制备针剂用。3、研磨后可以用PBS都可以将一般的蛋白溶解，对于容易形成沉淀的蛋白，可不可以试试采用萃取液来溶解蛋白呢胶点磨碎后加入萃取液（量要根据胶点的大小适当调整）在37度保温2小时，然后超声10分钟，将萃取液吸出，同样的操作在重复一次，最后把两次得到的液体混合冻干，即可。萃取液：5%TFA(三氟乙酸）：50%CAN（乙腈）
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【求助】切胶纯化蛋白
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小弟我有一个蛋白，在包涵体中，用尿素粗纯过，想接下来，进行切胶纯化，但是回收效率太低，请问各位大神，有没有除了PBS更好的溶解液，可以使蛋白的回收率提高？
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你说的回收率低，是指包涵体溶解出来的就少，还是切胶回收率低呢？如果是包涵体溶解效率低，溶解仅用PBS么，包涵体的溶解需要加入变性剂或者表面活性剂会改善很好，但如果你不想使用变性剂（复性难度大），我有一个比较好用的非变性溶解包涵体的办法，就是通过高PH及超声实现的，你不妨试试，我的很多蛋白都这样可以成功。
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蛋白切胶回收：先将蛋白跑胶，当然越多越好，用大梳子。但是胶的浓度推荐小一点，8％，这样在以后的研磨中会容易一些。还要注意溴酚蓝，因为有可能会遮盖你的蛋白，推荐用没有溴酚蓝的loading buffer，旁边跑一个对照有溴酚蓝的。0.3M KCl在4度浸泡5分钟，看到白色目的条带后切胶，常温中研磨到粉末，就象要从组织中提取RNA一样的研磨，越细越好。后加入适量的8M尿素的溶解液。混合均匀在37度温浴1个小时后12000rpm离心5分钟，然后取上清就ok。1，包含体沉淀直接用loading buffer溶解上样，当然要煮一下；2，制胶时浓缩胶不要灌满，留出离槽口1厘米的空间，当然也就不要插梳子了——胶凝固后，两侧用小心用琼脂糖封好，这样可以上更多的样品；为什么不用亲和，分子筛这些方法呢？这些方法比切胶纯化效果要好的多啊
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关于丁香园君，已阅读到文档的结尾了呢~~
海参自溶酶的纯化和性质研究,溶酶体,纤溶酶,溶酶体的功能,纤维蛋白溶酶,纤溶酶的作用,溶酶体贮积症,溶酶体疾病,纤溶酶注射液,溶酶体的形成
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