【中科起源】葡萄的组织培养快繁技术 - 中科起源生物组培设备仪器试剂耗材【中科起源】葡萄的组织培养快繁技术作者：中科起源生物组培设备仪器试剂耗材 / 微信号：zkorigin&发布日期: 1.葡萄脱毒组培快繁技术的研究与应用1.1葡萄试管快繁研究简史1944年，morel就开始了葡萄愈伤组织的培养。1955年Fallot、1959年Pelet等培养葡萄的茎生成不定根。1961年Galzy成功的培养了葡萄茎尖，并开始了葡萄低温离体保存，首创节培法。Mullines和Srinivasan（1976）第一个报道了葡萄体细胞胚胎发生。1978年曹孜义等从欧亚品种葡萄花药培养诱导出大量二倍体植株，同年Krul等也从杂种葡萄花药愈伤组织上诱导出大量不定胚。1978年Barlass和Skene报道了葡萄试管繁殖技术。1979年曹孜义等再国内首先报道了葡萄试管繁殖技术，并于次年建立了我国第一个植物组织培养的葡萄园。齐与枢、曹孜义等历经8年，完成了葡萄试管繁殖生产技术试验，并取得明显的经济效益和社会效益。1989年Mullines在第五界国际葡萄育种学术讨论会，做了“组织培养在葡萄遗传改良育种中的应用”的大会报告，总结了这方面的研究进展。“七五”、“八五”期间，国家把“葡萄脱毒及无苗试管繁殖技术”列入攻关计划，组织全国有关专家协作攻关，使葡萄离体快繁技术得到了很快的发展和应用。1.2 葡萄试管快繁的意义“葡萄试管繁殖是葡萄组织培养实际应用多、有成效和成熟的一项生物技术。”1.2.1 用语希缺良种的快速繁殖对新育成或选育的单株或新引进的良种，利用试管繁殖，可在短期内大量提供这些急需的良种苗木，以满足生产上的需要。“如Harris等（1982）用巴可品种3—4 mm长的茎，4个月生产出1.2完株苗Barlass等（1978）培养葡萄茎尖4个月成苗8000株。”“Monette(1989)用常规硬枝扦插1年仅得到12株苗，而试管苗繁殖每月得到了2000株苗。曹孜义、齐与枢等采用葡萄茎段培养，每月能增殖2.4—8.2倍，推算一个苗一年理论上可繁殖8.76万—222.3万株苗，实际上已做到一株先锋试管苗一年繁殖了3.1万株成苗。另外，一些珍惜杂交品种、纯合植株或转基因植株、多倍体植株也可用此法快速扩大繁殖。1.2.2 用于脱除病毒葡萄病毒类型繁多，危害较大，致使葡萄产量降低，品质变劣，病毒又很难防治，成为生产上一大威胁。利用热处理和茎尖培养相结合方法能有效的脱除病毒，该项技术已在国内外广泛应用。1.2.3 试管苗便于葡萄种质交换和保存葡萄试管苗无病虫，若在经过脱毒和鉴定为无病毒苗，则更便于地区间、国际间品种和种质资源的传递与交换，节省检疫和防治的人力、才力和时间。用试管苗保存葡萄种质，节省大量土地、劳力和时间，也免受病虫、病毒的侵染。1.2.4 有利于病理学、生理学及其他理论研究利用葡萄组织培养，常年均可提供生长旺盛的苗木或组织、细胞，供病理学、生理学研究，它是筛选杀菌剂和抗病品种及筛选植物激素的方法。组织培养空间小，条件易控制，不受季节限制，在加快遗传学、细胞学、生化学研究方面均有重要意义。2. 葡萄外植体的采集和消毒2.1 外植体是从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。组织培养所用的培养材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中根尖不易灭菌，一般很少采用。在快速繁殖中，“常用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5 cm左右”，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1 mm以下。葡萄脱毒过程中，外植体的大小与脱毒率高低成相关性，特别是茎尖培养，外植体太大不利于脱除病毒，太小又不容易培养成活，而且也不利于茎的生根。所以选取外植体的大小适宜在葡萄脱毒过程中应要掌握好，只要培养方法得当，用较大的茎尖作外植体，其消除病毒的效果也会很好，不一定都要用茎尖分生组织进行脱毒培养。葡萄在茎尖培养中，光的效果通常要比暗培养好。一般多采用光培养的方式，“试管苗培养适宜的温度是25+/-2度。”2.2防止外植体带菌2.2.1选择好外植体采集时期和采集部位2.2.1.1外植体采集以春秋为宜；2.2.1.2优先选择地上部分作为外植体；2.2.1.3阴雨天勿采，晴天下午采集；2.2.1.4采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。2.2.2室内或无菌条件下进行预培养。2.2.3外植体严格灭菌灭菌效果实验多次灭菌和交替灭菌2.3培养材料的消毒2.3.1先将材料用流水冲洗干净，后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。2.3.2在无菌坏境中将材料放入70％洒精中浸泡30－60s。2.3.3再将材料移入漂白粉的饱和液或0.01％升汞水中消毒10分钟。2.3.4取出后用无菌水冲洗三、四次。2.4制备外植体将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。“然后切成0.2－0.5 cm厚的小片，这就是外植体。”3. 培养基的成分及制备3.1 培养基的成分“组织培养过程中，外植体生长所需的营养和生长因子，主要是由培养基供应的。”因此，培养基中应包括植物生长必需的16种营养元素和某些生理活性物质。所有这些物质，可概括为5大类：3.1.1 无机营养物植物生长必须的有13种元素：氮（N）、磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、硫（S）、铁（Fe）、硼（B）、锰（Mn）、铜（Cu）、锌（Zn）、钼（MO）、氯（Cl）。前六种属大量元素，后七种属微量元素。培养基的各种盐类中均含有上述这些元素。无机氮可以两种形式供应，即硝态氮和铵态氮。有些培养基以硝态氮为主，另一些以铵态氮为主，多数二者兼而有之。铁往往以无机铁供应，如硫酸亚铁，为了防止沉淀，目前皆用螯合铁，即硫酸亚铁加乙二胺四乙酸钠配成。3.1.2 有机物质主要有两类：一是作为有机营养物质，为植物细胞提供碳、氢、氧、氮等必要元素，如糖类（蔗糖、葡萄糖和果糖）、氨基酸及其酰胺类（如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺）；另一类是一些生理活性物质，在植物代谢中起一定作用，如硫胺素（B1）、吡哆醇（B6）、烟酸、生物素、肌醇、单核甘酸及其碱基（如腺嘌呤等）。3.1.3 植物生长刺激物质主要加入植物天然的五类激素物质及其人工合成的类似生长激素物质，如生长素中常用的吲哚乙酸、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、吲哚丁酸；细胞分裂素中常用的有激动素、6苄基氨基嘌呤、玉米素；赤霉素类中常用的有赤霉酸；乙烯类中常用的有乙烯和乙烯利。3.1.4 其他附加物这些物质不是植物生长所必需的，但对细胞生长有益。琼脂(agar)是固体培养基的必要成分，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90℃以上的热水。琼脂条的用量在6—10g／L之间，琼脂粉的用量在3—4g／L之间若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。新买来的琼脂好先试一下它的凝固力。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。加入琼脂的固体培养基与液体培养基相比优点在于操作简便，通气问题易于解决，便于经常观察研究等，但它也有不少缺点，如培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。市售的各种琼脂几乎都含有杂质，特别是Ca、Mg及其他微量元素。因此在研究植物组织或细胞的营养问题时，则应避免使用琼脂。可在液体培养基表面安放一个无菌滤纸制成的滤纸桥，然后在滤纸桥上进行愈伤组织培养。其他替代物，有玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。活性炭（active carbon）可以降低组织培养物的有害代谢物浓度，对细胞生长有利；活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.5—l0g／L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5—羟甲基糖醛及激素等。抗生物质(antibiotic)，包括青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5—20mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤其对大量通气长期培养，效果更好。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%—10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，可能某些植物适宜用青霉素，而另一些植物却不大适应。值得提醒的是，在工作中不能以为有了抗菌素，而放松灭菌措施。此外，在停止抗生素使用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成。3.1.5 其他对生长有益的未知复合成分常用的为植物的天然汁液，如椰乳、酵母提取物、荸荠汁、苹果汁、生梨汁等。他们的作用是供给一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素物质等。葡萄组织培养中，用到的培养基种类很多，常用的是MS培养基，这里就将MS培养基配方列出 3.2培养基制备的基本方法3.2.1培养基配方的选定同一种培养基的配方在不同著作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。3.2.2培养基的制备记录每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。3.2.3培养基成分的称取培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方面军做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。3.2.4培养基各成份的混合和溶化培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。好使用不锈钢莴加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动、以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，后必须加以补足。3.2.5培养基pH的初步调正“因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。”例如，牛肉浸液约可降低pH 0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的终PH，保证培养基的质量。PH调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。3.2.6培养基的过滤澄清液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均而引起滤纸破裂。琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即将冷却至55~60°C的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入1~2个鸡蛋的蛋白，强力振摇3~5分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121°C加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可。3.2.7培养基的分装培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎（现试管一般多有用螺旋盖者）。分装时好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为洽当。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基终pH之用。3.2.8培养基的灭菌一般培养基可采用121°C高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50°C左右的培养基中。琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55℃-60℃时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。3.2.9培养基的质量测试每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其终pH。将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24~48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。3.2.10培养基的保存培养基应存放于冷暗处，好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。“每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。”4.愈伤组织和试管苗的培养“愈伤组织的培养一般来说，从接种外植体到出现愈伤组织，需要经过2周时间。”2周之内就可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭，不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长得更快。2周以后，由于培养基中的营养成分已接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养。愈伤组织的继代培养：进行继代培养所用的培养基，和培养愈伤组织所用的培养基相同。在严格的无菌条件下(接种箱内)将愈伤组织连同原来的外植体，一起移到新的培养基上。愈伤组织的继代培养，一代为20 d。如果延长培养时间，培养基中的营养物质会减少，外植体也会分泌一些有毒物质，造成自身中毒。20 d以后，可以根据愈伤组织的大小，决定是继续进行继代培养，还是进行试管苗培养。如果愈伤组织长到直径为1～15 cm　时，就可以进行试管苗培养，否则还需要进行第二次继代培养。在愈伤组织进行继代培养期间，可以将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光。愈伤组织见光后，颜色可以转为绿色。试管苗的培养当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的培养。试管苗的培养分为生芽培养和生根培养。要想培育出一株完整的试管幼苗，必须先进行生芽培养，然后进行生根培养。如果顺序颠倒，先诱导生根，就不好诱导生芽了。生芽大约需要4～6周的时间，而生根培养时，1周以后就可以见到幼根了。注意，试管苗应该进行见光培养。下面列出继代培养和试管苗培养的培养基配方。①继代培养和生芽培养的培养基配方是：MS培养基+6 BA(质量浓度为0.5～1.0 mg/L)+NAA(质量浓度为0.1～0.15 mg/L)。即在1L MS培养基中加入5～10 mL 6 BA和1～1.5 mL的NAA母液。NAA配合6 BA，可以促进不定芽的生长。②生根培养的培养基配方是：MS培养基+NAA(质量浓度为0.1～0.5 mg/L)。即在1LMS培养基中加入1～5 mL的NAA母液。NAA起促进生根的作用。影响试管苗继代培养的因素及解决措施试管苗的瓶内长满并长到瓶塞，或培养基利用完成时就要转接，进行继代，可迅速得到大量试管苗，以便到一定数量时进行移栽。能否保持试管苗的继代培养，是能否得到大量试管苗和能否用于生产的重要问题。4.1驯化现象在植物组织培养的早期研究中，发现一些植物的组织经长期继代培养，发生一些变化，在开始的继代培养中需要生长调节物质的植物材料，其后加入少量或不必加入生长调节物质就可以生长，此现象就叫作“驯化”。如在胡萝卜薄壁组织培养过程中，逐渐消耗了母体中原有器官形成有关的特殊物质。如初代中加入10-6 mol/L IAA，才能达到大生长量，但经多次继代培养后，在不加IAA的培养基上也可达到同样生长量，一般约在一年以上，或继代培养10代以上。但并不是出现这种所谓的驯化现象就好，有时长期的“驯化”现象会得到适得其反的结果，如卡德利亚兰实生苗在长期的加香蕉的培养基中继代，后造成只长芽不长根，芽的增长倍数很高，但芽又细又弱，这时在加入生长素的培养基中培养，几次继代可长出较多的根。4.2形态发生能力的保持和丧失5.瓶苗的移栽和锻炼外殖体繁殖的试管苗的能否大量应用于生产，特别是木本植物、名贵花卉能不能取得好的效益，取决于后一关，即试管苗能否有高的移栽成活率。试管苗移栽过程复杂，在未掌握其有关理论和技术时，若盲目移栽，势必造成高的死亡率，而导致前功尽弃。因此掌握有关理论和技术十分重要大力提高移栽成活率，建立高而稳定的移栽工序和方法是十分重要的。试管苗移栽后易于死亡的原因“试管苗一般在高湿、弱光、恒温下异养培养，出瓶后若不湿极易失水而萎蔫死亡。”从形态解剖和生理功能两方面分析其原因如下：5.1形态解剖方面5.1.1根根无根毛或很少在培养基上产生的根细小，无根毛。严重影响试管苗营养吸收和生瑰长，试管苗根系发育不良，根毛极少。葡萄试管苗生长在培养基内的根上无根毛，故试管苗移栽较困难。5.1.2叶在高湿、弱光和异养条件下分化和生长的叶，叶表保护组织不发达或无，易于失水萎蔫。这是因为：5.1.2.1叶表角质层、蜡质层不发达温室苗植株叶表光滑，无结构状的表皮蜡，或有极少数棒状蜡粒，经过炼苗，才诱导产生表皮蜡；而温室苗成熟叶上下表面均覆盖一层0.2 um×0.2 um的棒状蜡粒，幼叶片上也有，但少而已。有的试管苗叶表皮产生较多的蜡质。但产生原因有人认为是高温、高湿和低光造成的，也是人认为是激素影响的结果。5.1.2.2叶无表皮毛或极少保湿、反光性均差，故易失水。通过炼苗可以增强叶片的保水能力，维持其正常的新陈代谢，适应外界环境，提高免疫力。5.1.2.3叶解剖结构稀疏试管苗叶片未能发育成明显的栅栏组织。在葡萄炼苗过程中发现试管苗、温室苗和田间苗的叶栅栏细胞厚度、叶组织间隙存在明显差异，前者依次增加，而后者依次降低；上下表皮细胞长度差异不显著。未经强光闭瓶炼苗的试管苗，茎的维管束被髓线分割成不连续状，导管少，茎表皮排列松散、无角质，厚角组织也少。经强光炼苗的茎，维管束发育良好，角质和厚角组织增多，自身保护作用增强。试管苗叶组织间隙大，栅栏组织薄，易失水，加之茎的输导系统发育不完善，供水不足，易造成萎蔫，干枯死亡。5.1.2.4叶气孔突起，气孔口开张大试管苗叶气孔突起，气孔保卫细胞变圆，而温室植株气孔则下陷，保卫细胞椭圆。5.1.2.5叶片存在排水孔在葡萄试管苗叶片上除见到排水孔外，还看到一些假性水孔，这都是长期在饱合湿度下形成的，一旦移至低温下极易失水干枯。由上可以看出，在形态解剖方面试管苗无根系或不发达；无根毛或极少；叶无保护组织或极差，且叶组织间隙大，气孔开口大，故试管苗移栽后极易失水而干枯。5.2生理功能方面5.2.1根无吸收功能或极低葡萄试管苗根系吸收功能极低，仅为沙培苗的1/18，温室苗的1/39，低湿度下叶片大量失水，而根系又不能有效地吸水补充，故极易萎蔫、干枯。5.2.2叶片极易散失水分试管苗叶片无保护组织，加之细胞间隙大，气孔开张大，移于低湿环境中失水极快。曹孜义等（1991）把处于不同炼苗阶段的葡萄试管苗叶片切下，放在43%湿度下，“试管苗叶片20 min，光培苗1.5 h，沙培苗8 h，温室苗15 h后才萎蔫。”试管苗叶片极易失水，保水力极差，经过分步炼苗后，保水力才逐步增强。5.2.3试管苗气孔不能关闭，开口过大离体繁殖和生长的小植株，与温室和大田生长的小植株，气孔结构明显不同。气孔保卫细胞较圆，呈现突起。从观察的各类植物中，均报道试管苗的气孔是开放的，这种开放的气孔，用低温，黑暗、高浓度CO2、ABA、甘露醇等诱导气孔关闭的因素处理均无效，且气孔开张很大。曹孜义等（1993）报道葡萄试管苗气孔开口很大且呈圆形，甚至有些气孔开口的横径大于纵径。提出试管苗气孔不能关闭的原因是气孔过度开放，气孔口横径的宽度过大，超过了两个保卫细胞膨压变化的范围，从而不能关闭。这种过度开放的气孔，要经逐步炼苗后，降低了开张度，才能诱导关闭。从表皮细胞微纤丝所产生的纤维素、果胶质、角质等的组织化学研究指出，试管苗叶气孔是以非功能状态存在，当在一定湿度下气孔又以功能恢复。试管苗叶片缺乏角质和蜡质，气孔不能关闭，开口过大，试管苗失水萎蔫的主要原因是气孔不能关闭。5.2.4试管苗叶光合作用能力极低“试管苗生长在含糖培养基中，光和气体交换受到限制，因此光合能力很低。”葡萄试管苗、沙培苗和温室营养袋苗叶气孔阻力、蒸腾速率、净光合强度、叶绿素含量等，发现试管苗叶气孔阻力小，蒸腾速率高，叶绿素含量低，弱光下净光合速率呈现负值，而经过炼苗的沙培苗和温室营养袋苗，气孔阻力逐渐增强，蒸腾速率下降，叶绿素含量增加，净光合能力增强。认为试管苗叶片类似于阴处生长的植物，栅栏细胞稀少而小，细胞间隙大，影响叶肉细胞中CO2的吸收和固定。又因试管苗气孔存在反常功能，气孔一直开放，导致叶片脱水而对光合器官造成持久的伤害。在含糖培养基中，糖对植物卡尔文碳素循环呈现反馈抑制，以及CO2的不足，使叶绿体类囊体膜上存过剩电子流，造成光抑制和光氧化致使光合作用极低。试管苗光合能力低，是由于培养基中加有蔗糖，小苗体内吸收后，无机磷大幅度下降，减少了无机磷的循环，使RuBP羧化酶呈不活化状态，无力固定CO2或极少固定。同时，由于蔗糖的刺激，促使试管苗的呼吸速率增强，呼吸作用又大于光合作用。因此持续提高容器中的CO2的浓度，可以提高试管苗的光合效率。“但关于组织培养中蔗糖浓度高低与光合作用能力强弱仍存在争论，试验和结论不一致。”增加糖浓度，光强有利于培养壮苗，极显著提高成活率。从试管苗光合特性来看，在移栽前进行较强光照闭瓶炼苗，促使小苗向自养转化是有道理的。试管苗光合能力低，RuBP酶活性低，而呼吸作用强，PEP酶活性高，促进了蔗糖的吸收和利用，有利于氨基酸和蛋白质的合成，促使新的细胞和组织的形成。试管苗光合能力低也与叶绿体发育不良及基粒中叶绿素分子排列杂乱有关，除RuBP羧化酶活性低外（Tront，1988），光照和气体交换不充分也是一个限制因素。葡萄病毒给时世界葡萄栽培带来了巨大的危害，导致了不可估量的损失，同时也严重地制约着葡萄的优质，高效发展。因此，栽培无病毒葡萄具有重要的现实意义。欧美各国普遍推广栽培无病毒庙，“注意实施严格的苗木检测和生产制度，一些国家规定，只有无病毒苗方可用于繁殖和定植。”无病毒苗在生产中表现：一是生长势强、树体旺盛、主干茎粗壮、节约肥水；二是根系发达，定植生活率高；三使提高产量，增产幅度达20%—30%；四是病虫害少，抗逆性强，减少了农药的使用数量和次数，降低了成本。无病毒葡萄苗的突出优势增强了人们栽培它的积极性，现在在我国已推广栽培无病毒葡萄6700hm^2,并已获得了良好的示范效果.2001年烟台张裕集团—卡斯特酒庄投资了2000亩的无病毒酿酒葡萄圆,现已开始结果.烟台中粮葡萄酿酒有限公司在蓬莱南王山谷按国际化标准建立起了10000亩优质酿酒葡萄生产基地，在苗木选用时，烟台中粮葡萄酿酒有限公司摒弃了农民常用的混杂退化的老品种，而全部采用国内外名贵的赤霞珠、雷司令等系列优质脱毒苗木，这为生产优质葡萄奠定了优越的种植基础。目前，国家对果树良种的无毒化越来越重视，农业部已将果树无病毒良种苗木的繁育与推广等作为改良品种，提高质量的关键技术，列入丰收计划给予扶持，同时，还将果茶良种苗木的繁育纳入了“种子工程”，“分期分批投资建设国家果树脱度中心和省级果树良种繁育场，初步建立起果树良种苗木繁育体系。”农业部已经分别在华中农业大学、中国农业科学院果树研究所、中国农业科学院柑橘研究所，投资建立三个国家级果树脱毒中心。这将促进我国无病毒苗木生产迅速向产业化方向发展，使得葡萄的无病毒化栽培有了一个非常良好的发展前景。无病毒葡萄的栽培也定会为葡萄和葡萄酒的优质生产起到重要的作用。中科起源——开设组培学员培训服务，随到随学，包学会组培一站式服务（组培室设计规划+仪器试剂耗材采购+技术操作+资深专家辅导......）朋友，右上功能键分享到朋友圈微信公共号：搜索“zkorigin”官方网址：www.zkorigin.com服务热线：010-QQ:生物、组培实验室设备、仪器、试剂、耗材、服务等您来！相关文章猜你喜欢艺术品鉴赏文化资产托管中国南亚商务门户晋美画室中投教育集团#统计代码}