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链霉菌与ET12567（pUZ8002）接合转移问题求助已有1人参与
现在研三，一直在用ET12567（pUZ8002）做链霉菌的接合转移，研一研二做的好好的，整合型载体（如pJTU824，pSET152）能长满板，用fosmid做敲除也能长10个左右接合子；可就是后来怎么做都不成功，整合型载体都做不进去了，真是见鬼。。。想问问虫友们有没有类似的经历，或是有什么好的解决办法。
& &&&我们实验室使用TES热击后，加2*孢子萌发液，30 ℃预萌发的；我也试过用2*YT，可效果还是不理想。
(1)TES缓冲液：0.05M&&PH8.0
(2)2X孢子预萌发培养基：酵母膏，1%；酪蛋白氨基酸，1%；CaCl2,0.01M
1.带有oriT的目的质粒转化进入大肠杆菌ET12567( pUZ8002),得到转化子;
2. 将转化子的过夜培养物转接到5 mL含50 ug的Apr、卡那和氯霉素的LB中， 37 ℃，200 r/min培养转化子,到合适浓度(OD600:0.4-0.6)收集菌体;
3. 用等体积新鲜的LB洗涤菌体两次(洗掉抗生素), 1 mL的LB悬浮，备用;
4. 链霉菌孢子的热激和预萌发
(1)制备浓的孢子悬液
(2)新鲜孢子悬浮于2 ml&&0.05 M PH8.0 的TES;
(3)50oC水浴热激10分钟;
(4)冷却到室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基;
(5)37oC摇床分别培养2-３小时;
（6）离心收集孢子并重新悬浮于适量的水或TES中;
（7）在振荡器上打散孢子
5. 按(1*e-8)：(1*e-9)与3中的大肠杆菌混匀
6.&&30oC培养13-20小时左右用适当浓度的抗生素和萘啶酮酸（抑制大肠杆菌）覆盖
7.&&30oC培养数天（一般2-3天）可得到接合转移子.
8. 挑选接合转移子PCR验证;
还请大家不吝赐教，感谢。
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引用回帖:: Originally posted by 菁酱 at
还有还有，请问第六步，用抗生素和萘啶酮酸覆盖这个操作是什么意思啊？？先涂布混合菌液。等半天之后再涂药液吗？用不用涂布器把药液涂干吖？？不可以直接做成含药平板吗？
... 你好，用含有抗生素和萘啶酮酸的1 mL无菌水覆盖，超净台内吹干后30 ℃培养。不可以直接涂含抗生素培养基。
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【求助】关于细菌接合转移的细节求教，请做过此类实验的大虾不啬赐教
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这个帖子发布于6年零351天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
感谢各位大虾的帮忙，说明下情况小弟最近正在做细菌的结合转移实验，前期做过两轮，但实验结果不甚理想，觉得盲目地做还是不行，所以想针对接合转移的细节向大虾求教一二：1.供体菌与受体菌不来源于一个菌属，是否影响接合转移实验的成功率：
因为小弟所研究的供体菌为鲍曼不动杆菌，而实验室所有的受体菌均为大肠杆菌（目前大部分文献中也都是使用EC600或者J53的大肠杆菌，有极少数文献使用了沙门氏菌作为受体菌），供体菌属于莫拉菌科的鲍曼不动，而受体菌是属于肠杆菌科的大肠埃希，这两者进行接合转移是否存在影响，还是只要存在F质粒并且菌体具有性菌毛就能相互传播？？？2.菌体发酵时间问题
这个问题可能不算是接合转移的问题，因为实验和书本基本都是说取对数期的菌体做实验最佳，但对于每种菌甚至每株菌的生长对数期都是不一样的，查过相关文献，大部分都是以OD600 在0.4-0.6时为该菌株的对数期，但问题是培养基的量，接种的原始种子菌的量都没有一定的规定，因为种子菌的量会直接影响到OD600的数值，原本就很浓的菌液只培养一小段时间自然会很快达到OD600在0.4-0.6
基本上没有类似“0.5个麦氏浊度1ml 加到500ml的LB肉汤培养基中，37℃ 150-180转/分培养16小时”之类的描述......3.是否需要在培养基中加入一定浓度的抗生素
小弟对于第一步的在供体菌和受体菌培养时加入所对应的抗生素，理解是为了防止接种时带入其他杂菌以致影响培养（不知道是否还有其他的原因，希望大虾指点），那么对于进行接合转移时，供体菌和受体菌共同培养的培养基中是否应该加入各自对应的抗生素呢？？
如果加入抗生素会不会对接合子带来什么抗生素的压力诱导呢，还是应该在整个接合转移的过程中均不使用抗生素（基本上在超净工作台里工作，带入杂菌的可能性还是很小了）？？？3.接合子接种抗生素筛选平板时的接种方式：
实验室的师姐说对于接合子接种抗生素平板筛选时，她是直接将静置后的混合菌液摇匀然后用接种环挑去一环划线接种于抗生素平板，也有文献写是去适量菌液然后涂布在抗生素平板上，看起来后者似乎更好些，但问题是这个适量菌液到底是多少呢？4.接合转移有效率的指标
因为很少有文献提到接合转移的有效率问题，基本上都是报道成功或者失败，因此小弟想到底通过什么指标来反映那种温度、PH值、接种量等等条件下最佳的接合转移情况呢？
在国内一篇文献《大肠埃希氏菌耐药性水平传递研究》（西北农业学报，只帅，席魅力等）探讨了不同受供体比例、不同温度、不同时间等，但对于接合转移有效率的影响，但没有具体列出评价有效率的指标，在网络上看到，使用“接合转移率=（接合子菌数/受体菌菌数）*100%”来计算，但问题是一般的细菌计数（我所知道的就是将菌液比例稀释后与琼脂混匀倒板计数；直接涂布计数；类似细胞计数板计数这三种，也有说采用分光光度计的方式来与麦氏浊度比较）都很粗糙，这样是否能达到标准呢？？？以上就是小弟在接合转移实验中遇到的问题，希望各位大虾不啬赐教啊
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1.肠杆菌科细菌容易接合，鲍曼不动杆菌难度大，本人做过一两次没成功。个人觉得，EC600容易接合，且对利福平耐药，容易筛选。J53不好接合，而且很多临床分离菌对喹诺酮类耐药，所以用奈啶酸做筛选也不合适。2.对数生长期大概就是LB肉汤摇菌3-4小时。像肺炎克雷伯菌这种生长迅速的3h差不多了，EC600和鲍曼不动杆菌生长都比较慢，4h差不多。3.供体菌和受体菌共同培养的培养基不用加抗生素。接种方式。根据接合效率而定，结合效率高的10-20ul足以，可以长出几十或几百个单菌落，接合效率低的可以加100-200ul（如果量太大琼脂板吸收不了），用接种环均匀涂布。细菌长的一团糟除了可能是接种量太大，很多时候是因为筛选平板的抗生素浓度太低。4.个人认为接合效率也是粗略估计，很难绝对准确。很多文献都是写10-6~10-8。
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1.肠杆菌科细菌容易接合，鲍曼不动杆菌难度大，本人做过一两次没成功。个人觉得，EC600容易接合，且对利福平耐药，容易筛选。J53不好接合，而且很多临床分离菌对喹诺酮类耐药，所以用奈啶酸做筛选也不合适。2.对数生长期大概就是LB肉汤摇菌3-4小时。像肺炎克雷伯菌这种生长迅速的3h差不多了，EC600和鲍曼不动杆菌生长都比较慢，4h差不多。3.供体菌和受体菌共同培养的培养基不用加抗生素。接种方式。根据接合效率而定，结合效率高的10-20ul足以，可以长出几十或几百个单菌落，接合效率低的可以加100-200ul（如果量太大琼脂板吸收不了），用接种环均匀涂布。细菌长的一团糟除了可能是接种量太大，很多时候是因为筛选平板的抗生素浓度太低。4.个人认为接合效率也是粗略估计，很难绝对准确。很多文献都是写10-6~10-8。
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丁香园版主
一个实验做到如此细致,不容易~~~不知道你研究这个结合转移效率的目的, 一般做结合就是为了把一些不好转化的质粒送进去, 根本不在乎这个效率, 只要有一个结合成功的菌落生长起来, 就是实验成功.相信你肯定不是仅仅转个质粒~~~研究大肠杆菌获得外源基因的能力？
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&接合转移具体操作过程，请大家看看步骤有没有不妥的地方。
接合转移具体操作过程，请大家看看步骤有没有不妥的地方。
作者 chin_jl
一，大肠杆菌的复活就不谈了。。
二，链霉菌的热激和预萌发
　　１.链霉菌新鲜孢子悬浮于５ｍＬ预萌发液中。
　　２．５０℃水浴热激１０分钟后迅速放入冰中５分钟。
　　３.在加入等体积的孢子预萌发液
　　４．３７℃预萌发培养３小时。
　　５.用等体积无菌ｄｄ水洗涤孢子，１ｍｌｄｄ水重悬浮备用。
　　７.就是跟大肠杆菌按不同比例混合涂布了
　　８.用含有４０μｇ／ｍＬ萘啶酮酸和８μｇ／ｍＬ阿伯拉抗生素的１ｍＬ无菌水覆盖培养基。
那么我想问一下，覆盖的４０μｇ／ｍＬ萘啶酮酸和８μｇ／ｍＬ阿伯拉的浓度指的是什么？是萘啶酮酸和阿伯拉在一毫升无菌水里的浓度，还是指的是１ｍｌ培养基加４０μｇ的萘啶酮酸？再就是　这个方法，热激之后还要放在冰里５分钟，但是链霉菌操作手册上并没有这一步，有知道为什么的的　？
没人呢来嘛？自己顶一下
还没人来嘛？？
首先，如果针对这个链霉菌以前没有做过接合转移，也就是说没有成熟的接合转移系统，就应该先摸索条件，包括热激活温度，预萌发时间，孢子浓度，大肠杆菌浓度，盖药时间，盖药终浓度等等。
其次，链霉菌单孢子悬液需要用2×YT培养基洗涤两次。盖药浓度μｇ/ｍＬ级别应该是相对于培养基的终浓度，要是用含有４０μｇ/ｍＬ萘啶酮酸和８μｇ/ｍＬ阿伯拉抗生素的１ｍＬ无菌水盖药浓度有点低。
另外，你说的热激活后冰浴是不是相对于某种链霉菌的特定系统，一般的接合转移系统应该是没有冰浴这一环节的。
引用回帖:: Originally posted by cuihao102 at
首先，如果针对这个链霉菌以前没有做过接合转移，也就是说没有成熟的接合转移系统，就应该先摸索条件，包括热激活温度，预萌发时间，孢子浓度，大肠杆菌浓度，盖药时间，盖药终浓度等等。
其次，链霉菌单孢子悬液需 ... 大哥。。。您终于来了。。。之前就是用这个方法做的。。成功了，只不过现在用的质粒和之前的不一样了。。。在就是2×YT培养基怎么配置啊 ？之前师姐说用蒸馏水洗就好了。。再就是洗完离心的时候 孢子总是有悬浮。。。这个怎么处理啊 ，
之前成功了说明可以通过接合转移的手段将质粒导入受体菌中，换质粒将其中的一些条件微调下应该就可以。2×YT(%,W/V):Trytone 1.0，Yeast Extract 1.0，NaCl 1.0 pH 7.0。孢子有悬浮试着增加离心时间和转速。
引用回帖:: Originally posted by cuihao102 at
之前成功了说明可以通过接合转移的手段将质粒导入受体菌中，换质粒将其中的一些条件微调下应该就可以。2×YT(%,W/V):Trytone 1.0，Yeast Extract 1.0，NaCl 1.0 pH 7.0。孢子有悬浮试着增加离心时间和转速。 这和我的孢子悬浮液是一样的配方。。就是我的没有氯化钠。用的是氯化钙。。。用水洗可以不？
引用回帖:: Originally posted by cuihao102 at
之前成功了说明可以通过接合转移的手段将质粒导入受体菌中，换质粒将其中的一些条件微调下应该就可以。2×YT(%,W/V):Trytone 1.0，Yeast Extract 1.0，NaCl 1.0 pH 7.0。孢子有悬浮试着增加离心时间和转速。 再就是既然配方是一样的，那那个2X是什么意思？我之前一直理解的是浓度翻倍。。。我本来是想把浓度翻倍的。。。看样子不用翻倍了
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接合转移怎么这么难做啊已有4人参与
想把一个敲除的质粒通过结合转移的方式转到一个棒状链霉菌当中，做了几个月了还是没有做出来，哎！
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引用回帖:: Originally posted by jiangcheng14 at
换了个载体，转进去了已经
... 我用的pMD18-T，在lacZ位置插入接合转移位点，氯霉素抗性标记和同源臂，进行了接合转移，检验了一下没有整合到染色体上。我想请教一下，接合转移对质粒有什么要求吗。你换质粒是出于什么考虑的，谢谢了。
做自己最好！
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我也在做接合转移的敲除实验。你覆盖的抗生素使用浓度是按1mL无菌水算的还是按培养基体积算的？我之前做用前者老是抑制不住菌结果长一大片，最近用后者结果啥也不长了。
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我是按培养基算的，不长
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是的啊是的啊，我也在做
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