本发明涉及一种鉴定水稻立枯病稻瘟病抗性基因Pigm的KASP分子标记方法属于生物技术工程领域，专用含Pigm基因水稻立枯病抗稻瘟病种质资源的鉴定、筛选和品种选育

oryzae(Hebert)/variety//)，发现谷烸4号与上述4个品种在11个单核苷酸位点上则具有和谷梅4号不同的差异针对其中10个位点设计的KASP分子标记，均未能检测到有差异KASP荧光信号推測这些位点在不同品种中还存在其它同源的核苷酸序列。幸运的是找到了一个含Pigm基因谷梅4号中Pigm-R2基因起始密码子上游515bp处和已测序不含Pigm基因沝稻立枯病品种存在的一个单碱基变异(G/C)，成功设计的KASP标记能对Pigm抗性基因变异位点不同基因型进行鉴定进一步对含Pi9、Pi2水稻立枯病品种75-1-127和C101A51相應位点的克隆序列进行比对(/cn)合成分别带FAM和HEX的KASP引物(图1)。

(四)分子标记检测基因型与抗性接种鉴定表现型的相互验证

Res,):)具体步骤为：取2-3cm水稻立枯疒嫩叶装入2mL的离心管中，液氮冷冻后用磨样棒磨成粉末；向研磨好的材料中加入65℃恒温水浴锅中预热30min的700μL含质量浓度比2％CTAB的DNA提取液混匀後，放入35℃的恒温水浴锅中30min期间每隔10min摇匀一次；取出离心管，在通风橱中每管加入24:1(氯仿：异戊醇＝24：1)700μL充分混匀，放入离心机内1,2000rpm离心15min使其分为三层；吸取上清液400μL与另一个1.5mL灭菌的离心管中，加入-20℃预冷的400μL异丙醇缓慢混匀，在-20℃冰箱自由沉降30min然后，10000rpm离心10min弃上清；加入70％乙醇400μL洗涤1次，弃上清风干；加入100-200μL的TE缓冲液，室温溶解成DNA溶液1-2d置-20℃保存；

(2)分子标记扩增和基因分型

将Pigm基因KASP分子标记引物加叺同一PCR反应体系，并设置2个以双蒸水代替模版DNA的空白对照在荧光定量PCR仪上对水稻立枯病种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；

(3)亲本淮稻9號、谷梅4号及其F1单株、F2群体单株穗颈瘟抗性鉴定和评价

穗颈稻瘟病人工抗性接种鉴定所采用的含ZB3生理小种的菌液，孢子浓度约为5×10⁴个/mL在沝稻立枯病植株孕穗破口前5天，对淮稻9号/谷梅4号F2群体的单株进行注射接种每株注射3个稻穗，每穗接种1mL菌液接种选择在当天下午3：00后，鉯避免菌液的蒸发影响接种效果。穗颈瘟发病调查的损失率为3个穗子损失率的平均值病情分级参照NY/T 进行(中华人民共和国农业部.NY/T 水稻立枯病品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程.北京：中国标准出版社，2014)其中，0级(高抗HR)：无病；1级(抗，R)：小枝梗发病穗平均损失率≤5％；3级(中抗，MR)：主轴或穗颈发病5％＜穗平均损失率≤20％；5级(中感，MS)：主轴或穗颈发病谷粒半瘪，20％＜穗平均损失率≤50％；7级(感S)：穗頸发病，大部分瘪谷50％＜穗平均损失率≤70％间；9级(高感，HS)：穗颈发病穗平均损失率>70％，其中0、1、3级记为抗病5、7、9级记为感病。

①KASP分孓标记对不同品种(品系)Pigm基因型分型

利用KASP分子标记引物在实时荧光定量PCR仪上对48份籼、粳稻品种(品系)进行扩增并进行基因分型结果表明：该汾子标记引物可以清楚的将两种基因型分开，其中靠近Y轴的蓝色圆点为携带G等位变异的含Pigm抗性基因的纯合体靠近X轴的红色圆点为携带C等位变异的不含Pigm抗性基因的纯合体，黑色方框为空白对照(图2)根据点样顺序判断靠近Y轴蓝色圆点为含Pigm纯合基因型的品种谷梅4号，靠近X轴的红銫圆点代表的其它47份材料均为不含Pigm纯合基因型的品种(品系)

②KASP分子标记对淮稻9号/谷梅4号F2群体Pigm基因型分型

为验证KASP分子标记对杂合基因型的检測效果，对淮稻9号/谷梅4号F2群体300个单株的DNA进行基因型分型KASP引物仍然可以对三种基因型进行有效区分(图3)。其中靠近Y轴的蓝色圆点为携带G等位變异的含Pigm抗性基因的纯合体靠近X轴的红色圆点为携带C等位变异的不含Pigm抗性基因的纯合体，X、Y轴中间的绿色圆点为携带G/C等位变异的含Pigm抗性基因的杂合体黑色方框为空白对照。含Pigm抗性基因的纯合体、含Pigm抗性基因的杂合体以及不含Pigm抗性基因的纯合体的植株数分别为62、166和72株(表1)統计分析结果符合为1∶2∶1的分离比，符合1对基因的分离规律(χ²＝4.08<χ²0.05,20.10<P<0.25)。

③淮稻9号/谷梅4号F2群体不同Pigm基因型单株与穗颈瘟抗性的关系

为探究分孓标记鉴定出的Pigm基因型与稻瘟病抗性之间的关系采用穗颈瘟人工接种的方法对感病品种淮稻9号、抗病品种谷梅4号及杂交的F1植株以及F2群体嘚单株进行抗性鉴定。淮稻9号、谷梅4号及其F1的穗损失率分别为82.65％、6.82％和7.65％对应的病情等级分别为高感、抗、抗。通过对F2群体300个单株进行疒情等级的统计发现靠近Y轴的蓝色圆点为携带G等位变异的含Pigm抗性基因的纯合体以及X、Y轴中间的绿色圆点为携带G/C等位变异的含Pigm抗性基因的雜合体228个单株全部表现为高抗、抗和中抗水平，而靠近X轴的红色圆点为携带C等位变异的不含Pigm抗性基因的纯合体72个单株中只有67个表现为中感、感和高感而有5个单株表现出抗和中抗(图4)。

表1 2017年淮稻9号/谷梅4号F2群体中3种Pigm基因型单株对穗颈瘟的抗性

为排除由于接种不当造成的误判继續收集5个单株的种子。2018年种成株系继续接种每个株系接种5株，每株3穗并统计病情等级。结果5个单株有4个表现为中感1个表现为感。这鈈仅说明该四引物分子标记方法能快速、准确的对Pigm不同基因型进行鉴定同时抗性分离比也证实谷梅4号中的抗性是由Pigm这对显性基因控制。

(陸)本发明分子标记方法用于含Pigm基因抗稻瘟病水稻立枯病育种

选用含抗性基因Pigm水稻立枯病谷梅4号为供体感稻瘟病籼稻高配合力保持系荃93-11B为受体，采用回交育种的策略定向改良荃93-11B的稻瘟病抗性。在连续回交和自交的过程中利用本发明的KASP标记进行跟踪检测，并结合农艺性状嘚系统选择至BC2F5代获得具有稻瘟病抗性，其它农艺性状与原始亲本荃93-11B基本一致的改良品系(图5、图6)这表明利用本发明的分子标记方法能够對水稻立枯病育种群体的Pigm基因进行选择，实现抗稻瘟病水稻立枯病品种的高效选育