neuropathy,OPIDN)而发现的。OPIDN发生时,由于脊髓和外周神经的长轴突退变而导致下肢麻痹甚至瘫痪。有研究显示,NTE的抑制和老化被认为是OPIDN发生的前提条件。NTE是存在于内质网上的具有磷脂酶B催化活性的膜蛋白,在胚胎发育和神经发育中扮演着重要的角色。NTE蛋白的N端存在3个可与cAMP结合的调节域,提示NTE可能受cAMP的调节。目的:检测cAMP对NTE是否调节及其调节机制。方法:用放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)检测细胞内cAMP的含量;用western mRNA的表达情况;用薄层层析分离细胞内磷脂;用RNA干涉实验敲减细胞内CREB的表达:用荧光素酶报告基因检测NTE启动子区域的荧光素酶活性;用染色质免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,ChIP)实验检测CREB与NTE基因的启动子结合。结果:无论增加或降低cAMP都不能改变COS7和HEK293T细胞中外源性NTE的活性和蛋白表达水平;但增加cAMP可以增加HeLa细胞中内源性NTE酶活性,同时,NTE蛋白表达水平及mRNA水平相应增加;相反,如果降低cAMP水平,可导致细胞内源性NTE酶活性以及NTE蛋白表达水平与mRNA水平的降低。然而,用蛋白合成抑制剂环几亚酰胺(cycloheximide,CHX)抑制NTE蛋白合成以后,无论cAMP增加或降低对细胞内NTE活性都没有影响;用蛋白激酶A抑制剂H89抑制HeLa细胞内PKA活性,可以明显抑制细胞内NTE酶活性、NTE蛋白及mRNA的表达;在PKA活性被H89抑制后,再用forskolin增加细胞内cAMP的含量,细胞内NTE酯酶活性、NTE蛋白及mRNA的表达并没有明显地增加;HeLa细胞内cAMP增加可以促进甘油磷酸胆碱(glycerophosphocholine,GPC)含量的增加,而cAMP含量的降低和PKA活性被抑制可以降低细胞内GPC的含量;此外,NTE的过表达和敲减可以分别增加和降低细胞内GPC的含量;同时还发现,无论cAMP含量、PKA活性或NTE蛋白表达的增加或降低,细胞内卵磷脂(phosphatidylcholine,PC)的含量均无明显改变。这些结果提示,cAMP/PKA信号系统可以促进NTE蛋白的表达而增加细胞内GPC的含量。

产品类型 一抗 磷酸化抗体

研究领域 肿瘤 细胞生物 免疫学 信号转导 转录调节因子 激酶和磷酸酶

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