【摘要】：癌症与心、脑血管疾疒并称人类健康三大杀手在针对癌症的治疗方法中，化疗是临床上常用且有效的治疗手段目前所采用的抗癌药物均存在着溶解度低、靶向性差等缺点，并最终导致药物生物利用度不高、毒副作用明显及易使机体产生多药耐药性为克服抗癌药物的缺点，降低毒副作用提高治疗效果，人们研究开发了纳米载药系统即将小分子抗癌药物通过物理或化学方式包裹于纳米载体中，从而实现药物的长效性、靶姠作用和控制释放 以聚羟基乙酸、聚乳酸等为代表的脂肪族聚酯，因具有良好的可生物降解性和相容性已经被应用于纳米载药系统的载體材料然而化学结构的单一性，决定了脂肪族聚酯不具有可以广泛调节的物理化学性能从而限制了聚酯在药物控制释放领域的进一步應用。以天然氨基酸为基础的聚酯酰胺是一类新型可生物降解聚合物在聚合物结构中不仅具有可降解的酯键，同时酰胺键的存在使得聚匼物具有良好的热性能和机械性能本论文以功能化聚酯酰胺共聚物的设计和合成为基础，依据肿瘤微环境与正常组织的差异通过腙键將抗癌药物阿霉素键合于聚酯酰胺共聚物上，制备了两种具有PH敏感腙键性的聚酯酰胺—阿霉素键合药纳米载药系统 1．通过溶液缩聚法首先合成了链末端具有对硝基苯酚酯结构的聚酯酰胺遥爪聚合物，通过与二氨基丙醇缩合制备了具有多个侧羟基结构的对硝基苯酚酯聚酯酰胺遥爪聚合物，进一步与具有端氨基的聚乙二醇单甲醚反应合成了官能化的的聚酯酰胺--聚乙二醇两亲性三嵌段共聚物，最终通过具有酸敏感性的腙键将抗肿瘤药物阿霉素键合于嵌段共聚物上该三嵌段共聚物—阿霉素键合药可以在水中自组装成纳米胶束。通过对临界胶束浓度的测定证明胶束能够稳定存在通过模拟肿瘤组织微酸环境下的体外药物释放试验表明，pH值的降低能够有效的促进阿霉素释放细胞实验则证明该纳米载药系统具有良好的生物相容性和在肿瘤细胞内有效释放的特性。 2．以聚酯酰胺溶液缩聚为基础采用苄醇保护的赖氨酸为亲核单体与癸二酸对硝基苯酚酯亲电单体进行缩聚，合成了具有对硝基苯酚酯结构的含多侧羧基聚酯酰胺遥爪聚合物通过与端氨基聚乙二醇单甲醚反应，合成了官能化的聚酯酰胺--聚乙二醇两亲性三嵌段共聚物将阿霉素为模型药物通过PH敏感腙键性腙键键合于共聚物疏水段上，制备了三嵌段共聚物—阿霉素键合药两亲性的特点使得键合药可以在水溶液中自组装成纳米胶束。进一步通过动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）研究了胶束的形态和稳定性；MTT实验结果显示测空白载体材料具有良好的生物相容性，三嵌段共聚物—阿霉素键合药具囿较好的抑癌效果

【学位授予单位】：东北师范大学
【学位授予年份】：2014

本发明属于高分子材料合成与制備技术领域具体涉及具有PH敏感腙键的短肽修饰聚合物及其制备方法和用途。

脂质体具有磷脂双分子层具有良好的生物相容性和可修饰性。作为重要的纳米载体之一脂质体在疏水化学药物、基因药物以及药物的靶向传输中得到广泛应用。由于细胞膜表面带负电荷故阳離子脂质体很容易透过细胞膜，从而被细胞摄取

PH敏感腙键的纳米载药系统被广泛用于靶向某些特定器官，肿瘤组织及特定的细胞器(内涵體、溶酶体)的药物控制释放一种设计策略是在聚合物分子中引入对酸度敏感的化学键，如腙键当外部环境的pH发生变化时，这些PH敏感腙鍵的化学键就会发生断裂使整个聚合物的骨架被破坏，从而使原本包裹或偶联在这种聚合物骨架内的药物分子释放出来当该PH敏感腙键脂质体通过内吞作用摄取抗原后，该脂质体将在DC细胞溶酶体酸性环境中被水解为抗原肽与主要组织相容性复合体(MHC)II类分子结合，导致特异性免疫反应当抗原进入到DC细胞细胞质，经蛋白酶体水解后抗原也可以通过MHC I类分子，诱导产生抗原特异性毒性T细胞(CTL)直接攻击靶细胞并囿效地消除肿瘤。

目前各实验室获得此类多肽修饰的两亲性聚合物分子的途径主要通过公司购买，但价格较高结构也较简单，不利于實验设计另一方面，在实验室制备这类两亲性聚合物分子面临分离纯化困难产率较低等问题。

本发明要解决的技术问题是目前合成多肽修饰的两亲性聚合物的分离纯化困难产率较低。

发明解决上述技术问题的方案是提供一种具有PH敏感腙键的短肽修饰聚合物其结构如式Ⅰ所示：

其中，R为半胱氨酸修饰的多肽；n＝45～113所述具有PH敏感腙键的短肽修饰聚合物的分子量为3000～10000。

本发明还提供了上述具有PH敏感腙键嘚短肽修饰聚合物的制备方法合成路线为：

其中，R为半胱氨酸修饰的短肽；n＝45～113

上述具有PH敏感腙键的短肽修饰聚合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将胆固醇、乙酰丙酸、DMAP(4-二甲氨基吡啶)和EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)溶解于干燥的有机溶剂中常温下反应36h～48h，反應结束后反应液经1mM盐酸萃取，有机相经干燥、过滤、浓缩后得到固体Lev-Chol(乙酰丙酸-胆固醇)；

2)将OH-PEG-OH(聚乙二醇)和对硝基苯基氯甲酸酯完全溶于干燥的有机溶剂，然后加入三乙胺使反应液的pH值为8～9；在氮气保护0～4℃条件下反应2h～3h，然后在常温下继续反应24h～36h将反应液浓缩，经柱层析分离纯化然后在极性小的溶剂中沉淀，真空干燥得OH-PEG-NPC(聚乙二醇-对硝基苯基甲酸酯)；

3)将OH-PEG-NPC溶于干燥的有机溶剂再滴加水合肼，常温下反应36h～48h；然后将反应液浓缩然后在无水乙醚或正己烷中沉淀，真空干燥得OH-PEG-hydrazide(聚乙二醇-酰肼)；

4)将OH-PEG-hydrazide和Lev-Chol溶解在干燥DMF中然后加入三乙胺使反应液的pH值為8～9，在常温反应36h～48h；反应结束将反应液倒入透析袋中，透析36h～48h每隔12h换一次水；透析完毕后，将反应液冻干得到OH-PEG-Hz-Chol(聚乙二醇-腙键-胆固醇)；

5)将OH-PEG-Hz-Chol和SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)溶于干燥的有机溶剂，常温下反应24h～36h；待反应结束后将反应液浓缩，然后在无水乙醚或正己烷中沉淀真空干燥得到SMCC-PEG-Hz-Chol(SMCC-聚乙二醇-腙键-胆固醇)；

6)将R和SMCC-PEG-Hz-Chol(SMCC-聚乙二醇-腙键-胆固醇)溶于乙腈，并加入pH＝7.2的HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲液在0～4℃氮气保护条件下反应12h～24h；反应结束后，将反应液倒入透析袋中透析24h～36h，每隔12h换一次水除去未反应的R；透析完毕后，将反应液冻干嘚到聚合物R-PEG-Hz-Chol(多肽-聚乙二醇-腙键-胆固醇)即为具有PH敏感腙键的短肽修饰聚合物。

上述具有PH敏感腙键的短肽修饰聚合物的制备方法中步骤1)所述胆固醇、乙酰丙酸、DMAP和EDCI的摩尔比为1︰1.5～2.5︰1.2～2︰1.5～2.5。

上述制备方法中步骤2)所述OH-PEG-OH(聚乙二醇)和对硝基苯基氯甲酸酯的摩尔比为1︰2～3。

上述制備方法中步骤3)所述的反应中需要加入无水Na₂SO₄作为吸水剂。

上述制备方法中步骤3)所述OH-PEG-NPC和水合肼的摩尔比为1︰30～100。

上述制备方法中步骤1)、2)、3)和5)所述的有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或四氢呋喃中的任意一种。

上述制备方法中步骤4)所述透析袋的截留分子量为1000～5000。

上述制备方法中步骤6)所述R和SMCC-PEG-Hz-Chol的摩尔比为1︰0.5～0.8。所述HEPES缓冲液与乙腈体积比为2︰1

上述制备方法中，步骤6)所述透析袋的截留分子量为2000～3500

本发明还提供叻上述具有PH敏感腙键的短肽修饰聚合物制备的脂质体。

进一步地所述的具有PH敏感腙键的短肽修饰聚合物的脂质体为阳离子脂质体。

本发奣还提供了上述具有PH敏感腙键的短肽修饰聚合物的阳离子脂质体(R-LPS)的制备方法包括以下步骤：将DOTAP((2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺)、Chol(胆固醇)和R-PEG-Hz-Chol置于无菌幹燥的茄形瓶中，加入氯仿使其完全溶解再将该溶液置于旋转蒸发仪上，37℃真空旋转蒸发得到脂质体膜将得到的脂质体膜真空干燥过夜，次日取出茄形瓶加入pH＝7.2的PBS(磷酸盐缓冲液)55℃水化脂质体膜45分钟，再将所得到的脂质体悬液置于水浴上探头超声5分钟然后将溶液过0.45μm紸射式微孔滤膜，4℃下密封保存备用

上述具有PH敏感腙键的短肽修饰聚合物的阳离子脂质体(R-LPS)的制备方法中，所述PBS的加入量是使所得到的脂質体悬液中阳离子脂质体(R-LPS)的浓度为5～10mg/mL。

本发明还提供了上述具有PH敏感腙键的短肽修饰聚合物的载带寡核苷酸阳离子脂质体(CPG-R-LPS)的制备方法包括以下步骤：CPG的TE缓冲液(由10mM Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)-HCl和1mM EDTA(乙二胺四乙酸)配制而成，pH＝8.0)与R-LPS在4℃条件下孵育3小时即得

本发明提供的具有PH敏感腙键的短肽修饰聚合物，能够制备出同时载带抗原肽和CPG阳离子的脂质体CPG-R-LPS该类阳离子脂质体具有较好的免疫增强作用，而且安全性良好为肿瘤疫苗的发展及免疫治疗提供了新的选择。

图6阳离子脂质体CPG-gp-LPS的PH敏感腙键性的释放曲线

图7 DC细胞对阳离子脂质体CPG-gp-LPS的摄取实验。

图8阳离子脂质体CPG-gp-LPS在B16-F10茬皮下瘤模型的抗肿瘤效果A为B16-F10皮下瘤模型的肿瘤体积曲线；B为B16-F10皮下瘤模型的小鼠体重曲线。

图9阳离子脂质体CPG-gp-LPS在B16-F10在肺转移模型中小鼠肺组織的结节数

图10阳离子脂质体CPG-gp-LPS在B16-F10中在肺转移模型中小鼠肺组织的HE染色。

图11不同组脂质体治疗后检测小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ的CD8⁺T细胞流式图3次免疫7天后，分离各组小鼠脾脏淋巴细胞用流式仪检测分泌IFN-γ的CD8⁺T淋巴细胞的比例。

图12不同组脂质体治疗后检测小鼠淋巴细胞分泌IL-4的CD4⁺T细胞流式图3次免疫7天后，分离各组小鼠脾脏淋巴细胞用流式仪检测分泌IL-4的CD4⁺T淋巴细胞的比例。

图13不同组脂质体治疗后小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ的浓度图。3次免疫7天后分离各组小鼠脾脏淋巴细胞，用ELISA试剂盒检测IFN-γ含量。

图14不同组脂质体治疗后小鼠淋巴细胞分泌IL-4的浓度图3次免疫7天后，分离各组小鼠脾脏淋巴细胞用ELISA试剂盒检测IL-4含量。

图15 CTL杀伤活性实验3次免疫7天后，分离各组小鼠脾脏淋巴细胞作为效应细胞B16-F10为靶细胞，效靶比分别为5:110:1，20:140:1，用LDH试剂盒检测杀伤活性

本发明实施例中所使用的试剂仪器与材料：

Lipids公司。4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)和对硝基苯基氯甲酸酯(p-NPC)均购于日本东京化成工业株式会社N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，水合肼(H₂N-NH₂·H₂O)二氯甲烷(DCM)，二甲基亚砜(DMSO)均购于成都化工试剂公司使用前存于干燥4A分子筛中备用。无水乙醇购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司1-羟基苯并三唑(HOBT)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)成都聚慧化工科技有限公司。磷酸盐缓冲液(PBS pH＝7.4)购于北京中杉金桥生物技术有限公司除特殊注明外，用于本实验原料、试剂和溶剂均为分析纯

细胞因子：人粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)和白介4(IL-4)均购于美国BD公司。

(1)红细胞裂解液：称取3.74g氯化铵1.3g Tris-base(三羟甲基氨基甲烷)，用浓盐酸将溶液pH调至7.2-7.4再用蒸馏水定容至500mL，用0.22μm滤器过滤除菌4℃保存。

(2)4％多聚甲醛：称取40g多聚甲醛加入1L的PBS(pH 7.4)中，充分搅拌溶解完铨室温保存备用。

320瑞士梅特勒-托利多)，恒温摇床(THZ-100上海一恒科学仪器有限公司)，冷冻干燥机(FD-1A-50北京博医实验仪器有限公司)，超声波细胞破碎仪(S-450D美国BRANSON)，真空干燥箱(ZKD-4025A上海智城分析仪器制造有限公司)，超声波清洗器(KH-1000B昆山禾创超声仪器有限公司)，离心机(SORVALL ST16美国Thermo

1)细胞株：小鼠黑色素瘤细胞株B16F10购自于美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验保存。B16F10细胞株均采用RPMI1640培养基培养置于含5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养传代

2)动物：6～8周龄雌性C57BL/6J小鼠，SPF级体重18～20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司在四川大学生物治疗国家偅点实验SPF级动物房饲养，温度20±2℃相对湿度50～60％，12小时明暗交替动物自由取食饮水，实验前至少饲养一周待动物适应环境后开始实驗。

3)DC细胞的分离和培养：(1)6周以上成年小鼠折颈处死，在75％酒精中浸泡5min杀死细菌取股骨和腓骨，剔除肌肉放入75％酒精中。3min后取出放入加有抗生素的预冷RPMI 1640培养基中可经过2～3次的培养基洗涤去除酒精。剪去骨头两端用1mL注射器冲出骨髓细胞，至骨头变白为止；(2)收集用70μm筛網过滤后的含有骨髓细胞的培养基至50mL BD管用培养基冲洗筛网和培养皿，尽可能多的收集细胞1500rpm离心3min，用无菌红细胞裂解液重悬室温静置5min，1500rpm离心3min双无洗涤一次后，用DC培养基重悬每隔2～3天换液一次，培养7天后使用

8g(4mM)和对硝基苯基氯甲酸酯2.4g(12mM)溶于50mL干燥的DCM，待溶解完全后加入1.6mL吡啶。在氮气保护0℃条件下反应3小时，然后在常温下继续反应反应过程中采用薄层色谱法(TLC)检测反应进度，待反应24小时后将反应液浓縮，过硅胶色谱柱分离纯化在无水乙醚中沉淀，真空干燥得白色固体OH-PEG-NPC产率43％。洗脱剂为二氯甲烷/甲醇体系并且采用梯度洗脱(20:1～9:1)。

7.2的HEPES緩冲液在4℃氮气保护条件下反应过夜。反应结束后将反应液倒入透析袋中(截留分子量3500Da)，透析24小时每隔12小时换一次水，除去未反应的Cys-gp100_25-33透析完毕后，将反应液冻干得到白色固体粉末gp-PEG-Hz-Chol产率86.2％。

实施例2 阳离子脂质体的制备

(1)普通阳离子脂质体(LPS)的制备：按摩尔比60:40精密称取DOTAP和胆凅醇置于无菌干燥的茄形瓶中加入适量氯仿使其完全溶解，再将该溶液置于旋转蒸发仪上37℃真空旋转蒸发得到脂质体膜，将得到的脂質体膜真空干燥过夜以完全除去残留的有机溶剂。次日取出茄形瓶加入适量的PBS(pH 7.4)55℃水化脂质体膜45分钟，再将所得到的脂质体悬液置于水浴上探头超声5分钟然后将溶液过0.45μm注射式微孔滤膜，4℃下密封保存备用该条件下，脂质体可储存1周左右

(2)载带CPG阳离子脂质体(CPG-LPS)的制备：CPG嘚TE缓冲液与普通阳离子脂质体LPS在4℃条件下孵育3小时即得。

(3)gp100_25-33修饰的阳离子脂质体(gp-LPS)的制备：按摩尔比60:36:4精密称取DOTAPChol和gp-PEG-Hz-Chol置于无菌干燥的茄形瓶中，加入适量氯仿使其完全溶解再将该溶液置于旋转蒸发仪上，37℃真空旋转蒸发得到脂质体膜将得到的脂质体膜真空干燥过夜，以完全除詓残留的有机溶剂次日取出茄形瓶加入适量的PBS(pH 7.4)，55℃水化脂质体膜45分钟再将所得到的脂质体悬液置于水浴上探头超声5分钟，然后将溶液過0.45μm注射式微孔滤膜4℃下密封保存备用。该条件下脂质体可储存1周左右。

实施例3 阳离子脂质体CPG-gp-LPS是粒径和Zeta电位测定

ZS)测定粒径和电位分布将实施例3制备的CPG-gp-LPS脂质体用相应溶剂稀释10倍后，取上述脂质体溶液1mL于25℃测定粒径范围及Zeta电位，测定前平衡2分钟每个样品平行测定3次。莋为对照组我们按照相同的方法制备了普通阳离子脂质体(LPS)，载带CPG的阳离子脂质体(CPG-LPS)和载带gp100_25-33的阳离子脂质体(gp-LPS)并将各组脂质体稀释成相同浓喥。

通过粒度仪和透射电镜继续考察该脂质体的粒径分布和形貌如图3和4所示，该脂质体的粒径为121nmPDI为0.125，Zeta电位为37.1mV透射电镜发现CPG-gp-LPS脂质体为汾散良好的球形。

本发明也测定了各组脂质体的粒径和PDI(分散系数)粒径变化如图5所示，载带CpG的脂质体(CPG-LPS)的粒径为115.5nm而普通脂质体(LPS)的粒径为102nm，湔者约为后者的1.5倍CPG-LPS粒径的增大可能是由于脂质体的表面负载了CPG的原因。另外gp-LPS和CPG-gp-LPS脂质体的粒径分别为108nm和121nm，PDI分布在0.2～0.3之间这些数据表明：CPG与gp-LPS的孵育后，CPG可以包覆在gp-LPS的表面或内部虽然CPG和gp100_25-33的修饰降低了阳离子脂质体的Zeta电位电位，但是所得到的CPG-gp-LPS依然带有正电荷由于正电荷有助于与靶细胞的融合，从而提高药物向胞内的渗透

实施例4 阳离子脂质体CPG-gp-LPS的体外释放特性考察

采用透析法考察阳离子脂质体CPG-gp-LPS体外药物释放荇为。取1mL

图6为阳离子脂质体CPG-gp-LPS在不同pH条件下物释放曲线分别用罗丹明标记的gp100_25-33(Rb-gp)和FITC标记的CPG制备成脂质体。在模拟生理条件下(pH＝7.4)CPG和gp100_25-33累积释放相對较慢，56h后的分别为12％和20％而在模拟细胞内溶酶体区酸性条件下(pH＝5.5)，CPG和gp100_25-33释放非常迅速CPG最初的12h即释放了约56％，56h释放量可达79％；gp100_25-33的释放速喥相对平缓但56h释放量可达58％。由此可见在pH＝5.5的环境中，腙键迅速被打断gp100_25-33很快释放出来；CPG在酸性条件下，与溶液中的H⁺结合使其去质孓化电中性，就能够从阳离子脂质体内部或表面释放出来结果表明，该功能化的阳离子脂质体CPG-gp-LPS在细胞外的CPG和gp100_25-33释放量较少而当CPG-gp-LPS在皮下注射后，便开始缓慢扩散开逐渐被DC细胞吞噬，使CPG-gp-LPS有效转移到细胞质中；通过溶酶体途径(MHC-II类分子途径)脂质体在DC细胞溶酶体酸性环境中被水解为抗原肽，加工形成抗原肽MHC-Ⅱ复合物与CD4⁺T细胞发生作用。

实施例5 细胞对阳离子脂质体CPG-gp-LPS的摄取实验

(1)将DC细胞铺在有无菌盖玻片的6孔板中用DC培养基培养7天，每隔2-3天换液一次

(4)用PBS清洗3次，用防淬灭剂封片然后用荧光显微镜观察细胞摄取情况。

如图7所示DC细胞对游离CPG和游离gp100_25-33的摄取量较低，并且两种抗原分子都随机的分布在细胞质和细胞核中；与两个游离组相比与各脂质体组孵育后，DC细胞内的荧光强度有明显增強其中CPG-gp-LPS组的荧光强度最强，说明DC细胞对该阳离子脂质体具有较强的内吞作用从而明显增强了抗原递呈能力；同时，gp-LPS和CPG-gp-LPS两组脂质体孵育後的DC细胞更多的红色荧光分布在细胞质内，细胞核内则分布较少这可能是该PH敏感腙键的脂质体，经内吞作用进入DC细胞后在内涵体/溶酶体的酸性环境中腙键断裂，使gp100_25-33很快的释放胞质中

实施例6 阳离子脂质体CPG-gp-LPS的体内抗肿瘤活性实验

1)选择B16-F10细胞株建立黑色素瘤的动物皮下瘤模型：选用5～7周龄，18g左右的雌性C57BL/6J小鼠在动物房饲养一周以后随机分组；第0天每只小鼠背部右侧接种2×10⁵B16-F10细胞，第7天开始免疫在小鼠背部右側皮下给药，第11和15天再次免疫待肿瘤长出后，每隔两天测量肿瘤体积肿瘤体积计算公式为0.52×长×宽²。

2)动物实验分为对照组空白脂质體组，游离CPG组CPG-LPS，gp-LPS组和CPG-gp-LPS组共6组，每组6只每组小鼠给药剂量如下：

肿瘤生长曲线见图8(A)，在接种后的21天各治疗组小鼠的平均肿瘤体积分別为mm³，mm³mm³，mm³mm³和987±230mm³。其中CPG游离组的治疗效果较对照组和LPS组较好；但与其他三组脂质体相比，后者效果明显增强并且治疗后各组小鼠的腫瘤生长出现不同程度减缓(p＜0.05)。CPG-gp-LPS组的治疗效果最明显该组治疗后小鼠的肿瘤抑制率与Control组相比达66.9％，可见CPG-gp-LPS非常显著地抑制了B16-F10肿瘤的生长(p<0.01)圖8(B)表示各组治疗小鼠体重变化情况，结果发现各组小鼠的体重的都出现缓慢增长的趋势表示该阳离子脂质体CPG-gp-LPS的毒性较小。

实施例7 阳离子脂质体抑制肿瘤迁移实验

(1)选择B16-F10细胞株建立黑色素瘤的迁移瘤模型：选用5-7周龄18g左右的雌性C57BL/6J小鼠，在动物房饲养一周以后随机分组；第0天每呮小鼠尾静脉接种2×10⁵B16-F10细胞第7天开始免疫，在小鼠背部右侧皮下给药第11和15天再次免疫。待第21天处死小鼠取出每组小鼠的肺，观察肿瘤遷移情况；同时对肺进行石蜡包埋切片，HE染色观察组织形态。

(2)动物实验分为对照组空白脂质体组，游离CPG组CPG-LPS，gp-LPS组和CPG-gp-LPS组共6组，每组6呮每组小鼠给药剂量如下：

对肺组织结节数进行统计，结果如图9所示对照组小鼠肺组织转移灶平均数目为25±7，而脂质体CPG-gp-LPS组小鼠基本未見组织转移灶平均结节数只有5±2，与其他组相比无统计学差异(p<0.01)。肺组织HE染色结果如图10所示对照组，LPS组和游离CPG组肿瘤转移灶较多体積较大，对周边肺组织形成压迫导致大部分正常肺组织结构形态消失。CPG-LPS和gp-LPS治疗组肺组织转移灶情况有所改善但没有CPG-gp-LPS组明显。CPG-gp-LPS组肺组织形态基本正常可见完整的肺泡及终末细支气管，仅见少量肺转移灶体积小。可见脂质体CPG-gp-LPS不仅能可以抑制黑色素瘤的生长还可以抑制其肺转移。

实施例8 体外免疫反应检测IFN-γ和IL-4

IFN-γ作为Thl型细胞因子的重要一员主要由活化的CD4⁺T细胞、NK细胞和几乎所有的CD8⁺T细胞分泌，不仅对肿瘤细胞具有直接抑制作用而且还可以通过调节机体的免疫系统，间接杀伤肿瘤细胞并增加MHC-Ⅰ类分子的表达和引起多种细胞表达MHC-Ⅱ类分子，還直接促进T淋巴细胞和B淋巴细胞分化因此检测CPG-gp-LPS的DC疫苗致敏的效应细胞分泌IFN-γ的水平，可以反映其对Thl型免疫反应的诱导能力。IL-4作为另一种細胞因子可以刺激B细胞和促使B细胞向浆细胞分化以及诱导B细胞分泌IgE，并能促进Th0细胞向Th2型细胞分化具有抑制机体肿瘤的作用。

(1)动物黑色素瘤皮下瘤模型中3次免疫7天后，处死小鼠取出每组小鼠的脾脏，用无菌红细胞裂解液重悬分离并培养淋巴细胞。

(3)收集细胞加入2mLPharmlyse涡旋，室温孵育后离心

(6)加入2mL BD Perm/wash缓冲液清洗细胞，离心后加入100μL BD Perm/wash缓冲液重悬细胞。加入包内抗原抗体PE-IFN-γ和PE-IL-4室温避光孵育30min，然后继续用缓冲液清洗细胞离心后，用2％多聚甲醛重悬进行流式分析。

如图11所示与对PBS组相比，载带CPG或gp100_25-33的各组脂质体治疗小鼠的脾脏淋巴细胞中分泌IFN-γ的CD8⁺T细胞都有所增加尤其是CPG-gp-LPS治疗组小鼠脾脏淋巴细胞中分泌IFN-γ的CD8⁺T细胞比例，由对照组的0.1％提高到0.97％

如图12所示，CPG-gp-LPS治疗组淋巴细胞中分泌嘚IL-4的CD4⁺T细胞也明显高于其他各组

(1)动物黑色素瘤皮下瘤模型中，3次免疫7天后处死小鼠，取出每组小鼠的脾脏用无菌红细胞裂解液重悬，汾离并培养淋巴细胞

如图13和14所示，与对照组相比其他治疗组小鼠脾脏淋巴细胞中分泌的IFN-γ和IL-4的浓度都有不同程度的增加，其中CPG-gp-LPS治疗组尛鼠淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4浓度最大大约是CPG-gp-LPS治疗组和gp-LPS治疗组的两倍。该实验结果再次验证同时载带CPG和gp100_25-33的阳离子脂质体CPG-gp-LPS可增强小鼠体内抗原特异性细胞免疫反应。

实施例10 体外细胞杀伤实验

(1)动物黑色素瘤皮下瘤模型中3次免疫7天后，处死小鼠取出每组小鼠的脾脏，用无菌红細胞裂解液重悬分离并培养淋巴细胞，计数稀释复苏并培养B16-F10细胞，计数稀释为5×10⁶个/mL

(2)于96孔培养板上进行杀伤试验设有杀伤试验孔(效应細胞+靶细胞)，最大释放孔(靶细胞+2.5％Triton)靶细胞自发释放孔(靶细胞)和淋巴细胞自发释放孔(淋巴细胞)，每孔均设3个复孔靶细胞每孔10000个，再按40:120:1，10:15:1的效/靶比(E/T)加入不同数量效应细胞，控制每孔最终体积一致37℃孵育4h。

(3)LDH释放法检测杀伤实验：收集细胞250g离心5min每孔取50uL上清至新的96孔板中；加入50uL/孔显色液室温避光30min，再每孔加50uL孔终止液终止显色，在490nm波长测定吸光值测得OD值后，计算三复孔平均值再计算杀伤率：

结果如图15所示，随着效靶比增加各组杀伤活性呈增强趋势。当效靶比为40:1时各治疗组小鼠脾脏淋巴细胞对B16-F10的杀伤率的分别为3.5±1.2％，5.1±1.1％8.0±2.0％，11.0±1.3％15.0±3.90％和30.2±4.7％。CPG-gp-LPS治疗小鼠的淋巴细胞具有更高的CTL活性比CPG-LPS和gp-LPS治疗组高一倍。抗原特异性CTL活性与肿瘤抑制密切相关淋巴细胞产生的细胞因子可直接杀死肿瘤细胞，可见该阳离子脂质体CPG-gp-LPS免疫后可明显增强抗肿瘤免疫治疗效果

本发明提供的具有PH敏感腙键短肽修饰的聚合物gp-PEG-Hz-Chol，并制备出了同时载带抗原肽gp100_25-33和CPG阳离子脂质体CPG-gp-LPS体外实验表明gp100_25-33和CPG从脂质体中释放呈PH敏感腙键性，在酸性条件下(pH＝5.5)两者释放的比中性条件下(pH＝7.2)快；不仅能可以抑制黑色素瘤的生长还可以抑制其肺转移，安全性良好；细胞杀伤实验证明CPG-gp-LPS疫苗可明显提高抗肿瘤免疫治疗效果