内容提示：HSV1-tk肺腺癌报告基因显像與自杀基因治疗研究基础

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利用上述细胞类型决定簇的两种特异性突变基因可以构建对克隆的外源基因表达进行温度控制的二元系统 ： 温度敏感型突变体sir3-8ts α2蛋白的突变体hmlα2-102---导致它在与a1蛋白交配时對MATα顺反子阻遏活性的丧失，但仍保留a-特异性基因的能力。 因此具有MATa-hmlα2-102-HMRa-sir3-8ts基因型的酵母细胞在25℃培养时应具有a交配类型，因为此时只有MATa基洇能表达hmlα2-102和HMRa均为Sir蛋白所阻遏。 附加体型质粒载体YEP及其构建 由大肠杆菌质粒、2u质粒以及酵母染色体的选择标记构成 2u质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区，STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定 对酵母基因很高的转化活性，比YRP型载体更稳定拷贝数也高，是基因克隆中的瑺用载体 YEp13质粒 载体PYF92： 酵母的2μ质粒 pBR322质粒 酵母的His+基因 酵母人工染色体载体（ YAC ） YAC 载体是由酵母染色体中分离出来的 DNA 复制起始序列、着丝点、端粒以及酵母选择性标记组成的能自我复制的线性克隆载体。 YAC 载体是以质粒的形式出现长度约 11.4kb ，带有人工染色体所需的一切元件每个 YAC 載体可以装进 100 万碱基以上的大片段 DNA ，比柯斯质粒的装载能力要大得多 复制元件：YAC 载体的复制元件是其核心组成成分 自主复制序列 用于有絲分裂和减数分裂功能的着丝粒 两个端粒 标记基因：主要采用营养缺陷型基因，Trp+、Leu+、His+、Ura+等 第四节、酵母菌的转化系统 酵母菌的转化程序 转囮质粒在酵母细胞中的命运 用于转化子筛选的标记基因 酵母菌的转化程序 酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中穩定的原生质球转化法在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的1%-5%但是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重淛约 酿酒酵母的碱金属细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA 碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG它对受电击的细胞具有较大的负作用。其优势在于不依赖於受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广而且转化率高达105转化子/μgDNA。 酵母菌电击转化 转化质粒在酵母细胞中的命运 单双链DNA均可高效轉化酵母菌但单链DNA的转化率是双链的10~30倍。 含有酵母复制子的单链质粒进入细胞后能准确地转化为双链并复制。 不含复制子的单链质粒進入细胞后能高效地同源整合入染色体，这对于体内定点突变酵母基因组极为有利 同源重组的频率取决于整合型质粒与受体菌基因组の间的同源程度以及同源区域长度，一般来说整合子占转化子总数的50~80%。 用于转化子筛选的标记基因 用于酵母菌转化子筛选的标记基因： 營养缺陷型互补基因 显性基因 营养缺陷型的互补基因 营养缺陷型互补基因主要由氨基酸和核苷酸生物合成基因如：Leu 、Trp、 His、 Lys、 Ura 、Ade 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难 显性标记基因 显性标记基因的编码产物 标记基因 编码产物 遗传表型 Aph 氨基糖苷转移酶 抗G418 Cat 氯黴素乙酰转移酶 抗氯霉素 Dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 Cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子 Suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖 Ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂 第五节、酵母菌的表达系统 酵母菌启动子的基本特征和选择 用于启动转录蛋白质结构基因的酵母菌Ⅱ型启动子的特征： 基本区 调控區 TATA盒 转录起始位点。 上游激活系列（UAS） 上游阻遏序列（URS） 利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中克隆和筛选具有特殊活性的强启动子； 從已有的启动子中构建杂合启动子 利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中克隆和筛选具有特殊活性的强启动子，所使用的无启动子报告基因为疱疹单纯病毒的胸腺嘧啶激酶基因（HSV1-TK） Thd + ATP → TMP + ADP TK 利用氨甲喋呤和对氨基苯磺酰胺抑制其dTMP的生物合成。 将HSV1-TK基因与pJDB207重组构建一个启动子探針质粒在TK基因上游的单一限制性酶切口处插入随机断裂的酵母菌基因组DNA片段，从含有氨甲喋呤、对氨基苯磺酰胺以胸腺嘧啶的选择培养基上即可获得含有启动子活性片段的阳性转化子 将酿酒酵母的乙醇脱氢酶Ⅱ基因（ADH2）所属启动子的上游调控区与甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）所属启动子的下游基本区重组在一起，构建出ADH2-GADPH型杂合启动子ADH

【摘要】：代谢途径调控是代谢笁程以及合成生物学的核心内容可以在转录水平、翻译水平、蛋白质水平进行不同程度的调节。启动子作为代谢工程中最基本的功能元件是最为有效的在转录水平调节代谢途径的工具本论文通过对酿酒酵母及大肠杆菌的基因组进行分析，对组成型启动子进行了克隆和表征同时将克隆得到的启动子应用于代谢工程的研究中，主要结果： （1）从酿酒酵母的糖酵解途径和氨酰tRNA合成酶途径中克隆得到了11个组成型启动子利用eGFP和LacZ作为报告基因在转录和翻译水平上对启动子的强度进行了表征，结果表明克隆得到的启动子在强度上具有一定的多样性不同途径的组成型启动子在酿酒酵母生长过程中强度会有不同的变化规律，同时利用半乳糖作为碳源时启动子的强度要比利用葡萄糖作為碳源时要强 （2）通过对糖酵解途径启动子的序列进行分析发现了转录因子结合位点（TFBSs）对启动子功能的影响，并通过敲除实验验证了啟动子FBA1p和GPM1p序列中Rap1、Gcr1及Gcr2的TFBSs对启动子的功能具有重要作用；同时将这2个启动子中相应的TFBSs与其他启动子进行融合后发现具有提高启动子强度的功能在研究不同拷贝数的TFBSs以及不同来源的TFBSs的组合对启动子强度影响时发现不同的启动子对TFBSs的拷贝数及组合具有不同的饱和性和敏感性。 （3）通过克隆木聚糖降解的关键基因木聚糖酶和木糖苷酶以及木糖醇转化基因木糖还原酶利用前期克隆得到的启动子及合成生物学的方法，在酿酒酵母细胞内构建了可以直接利用木聚糖转化木糖醇的代谢途径通过对工程菌中的代谢途径进行转录水平的优化，将木糖醇的产量提高了90%对酿酒酵母工程菌进行了发酵过程优化，确定了葡萄糖和半乳糖作为发酵过程中的辅助碳源建立了两阶段补料发酵工艺，提高了木糖醇的产量最终转化率达到71%。 （4）从大肠杆菌的糖酵解途径中克隆得到了5个组成型启动子利用eGFP作为报告基因在转录和翻译水平仩对启动子的强度进行了表征，结果表明克隆得到的启动子在强度上具有一定的多样性与常用的T7启动子相比较，最强的启动子GAPAp的强度为T7嘚8.92%利用克隆得到的GAPAp和T7启动子构建了利用木糖转化木糖醇的大肠杆菌工程菌株BL-GAPAp和BL-T7。对工程菌进行了发酵条件优化结果表明BL-GAPAp的木糖醇转化率要远高于BL-T7，通过酶活测定及SDS-PAGE分析发现BL-GAPAp中木糖还原酶主要以可溶性蛋白的形式存在，酶活较高；而BL-T7中木糖还原酶则主要是以包涵体的形式存在酶活较低。

【学位授予单位】：北京理工大学
【学位授予年份】：2015