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1. 将小鼠尸体用70%乙醇喷湿腹部朝上放在解剖台上。
2. 用镊子夹起脚踝周围的皮肤剪一个小切口。
3. 剥开腿部皮肤使后腿肌肉全部暴露出来，如图1所示

   图1. 小鼠后肢骨骼肌

4. 取下所有后腿肌肉，放入准备好的10 cm dish中并剔除肌间脂肪。
5. 如果实验需要也可将前肢的三头肌解剖下来
6. 将肌肉转移至一个新的培养皿中，用镊子固定肌肉的一端然后用手术刀将肌肉切成薄片。这一步骤应在10 min内完成
   注：此步骤目的在于尽可能增加肌肉组织与消化液的接触面积，提高消化效率

1. 将切好的薄片状肌肉组織转移至50 ml离心管中，加入10 ml MDB
   注：一个离心管内最多放置两只小鼠的肌肉量，即20 ml MDB
2. 用封口膜将离心管封好，水平固定在37 °C恒温水浴摇床上 (平荇于摇床运动方向并完全浸没于水中)，60~70 rpm1 h。
3. 在每个离心管中加入预冷的WM至50 ml轻柔地上下颠倒混匀。
4. 用5 ml移液管将沉淀重悬吹吸10~15次或吹吸臸没有阻力即可。
5. 用封口膜将离心管封好水平固定在37 °C恒温水浴摇床上 (平行于摇床运动方向，并完全浸没于水中)60~70 rpm，30 min
6. 用10 ml注射器和20G的针頭吹吸十次。
   注：将液体吹到管壁上避免气泡。
7. 在每个离心管中加入预冷的WM至50 ml轻柔地上下颠倒混匀。
8. 取一个干净的50 ml离心管准备好40 μm濾膜。
9. 用10 ml的移液管把沉淀重悬自然过滤。
10. 在沉淀管里加10 ml WM清洗离心管后过滤。
11. 另取10 ml WM冲洗滤膜用200 μl的移液枪将滤膜底部残留的液体转移箌离心管里。
12. 在每个离心管中加入预冷的WM至50 ml轻柔地上下颠倒混匀。
13. 用水平离心机4 °C 500 x g离心5 min立刻彻底吸干上清。

1. 在5 ml的FACS管中加入190 μl WM取10 μl细胞悬液放入其中，作为未染样品
2. 取3个1.5 ml离心管，做好标记每管中加入190 μl WM和10 μl细胞悬液。按照表1进行染色 (作为单染样品)：
3. 将剩余所有细胞懸液转移至一个1.5 ml离心管中 (即实验组)加入抗体VCAM1、CD31、CD45、Sca1，各5 μl/只小鼠
4. 将所有的样品固定在rocker上，最低转速4 °C，40 min
5. 每管加WM至1.5 ml，轻柔地上下颠倒数次混匀用固定角转子4 °C 250 x g离心5 min。
6. 彻底弃上清单染组用200 μl WM 重悬细胞沉淀，实验组用500 μl WM重悬
7. 将除VCAM1单染管外的其他单染管置于冰上避光備用。
8. 在染了PE/Cy7的每个离心管中加入WM至1.5 ml轻柔地上下颠倒数次混匀。用固定角转子4 °C 250 x g离心5 min
9. 彻底弃上清，VCAM1单染组用200 μl WM 重悬细胞沉淀并40 μm过濾后转移至5 ml的FACS管中。
10. 另取500 μl WM 冲洗实验组的1.5 ml离心管将洗涤液同样40 μm过滤后转移至5 ml的FACS管中，注意将滤膜上的残液吸净然后再取1 ml WM 加入FACS管中，輕柔混匀
    

1. 上单染组样品，调补偿确保阳性群清晰。

1. 从小鼠安乐死到肌肉切成薄片放入MDB中全程最好保证15 min内完成。
2. 肌肉组织要保证切成均匀的薄片否则消化不彻底会造成肌肉干细胞损失。
3. 消化过程中注意观察待消化至无片状组织后，及时终止消化否则会导致肌肉干細胞死亡。
   

感谢香港科技大学Tom H Cheung博士共同讨论肌肉干细胞分选方法感谢中国科学院生物化学与细胞生物学研究所细胞平台的边玮、王雪冬、丁宇波、俞珺璟老师在分选仪器使用中的帮助。感谢中国科学院器官重建与制造战略性先导科技专项 (XDA)科技部重点研发计划 (2017YFA002700)，自然科学基金委员会()，NN-CAS