(2019·山东青岛质检)长春花是原产于非洲东海岸的野生花卉其所含的长春碱具有良好的抗肿瘤作用。基因tms的编码产物能促进生长素的合成科研人员利用基因tms构建重组Ti质粒，对愈伤组织进行遗传改造解决了长春碱供不应求的问题，操作流程如下请回答下列问题：

(2)若从基因文库中获得基因tms，则从______________(填“基因組文库”或“cDNA文库”)中获取的基因含有启动子启动子的功能是______________________。作为载体的Ti质粒应含有____________用以筛选含目的基因的细胞。

(3)用PCR技术扩增目的基因含有目的基因的DNA受热变性后解旋为单链，________与单链相应互补序列结合然后在Taq酶的作用下延伸，如此重复循环

(4)长春碱杀死癌细胞的哃时对正常细胞也有毒害作用，为降低长春碱对正常细胞的毒性可以利用__________制备技术制成“生物导弹”进行靶向治疗。

　(1)脱分化　农杆菌轉化法　(2)基因组文库　驱动目的基因转录出mRNA　标记基因　(3)引物  (4)单克隆抗体

解析　(1)外植体通过①脱分化形成愈伤组织②把目的基因导入植粅细胞常用农杆菌转化法。

(2)cDNA文库是利用RNA反转录形成的从中获取的基因不含启动子，而从基因组文库中获取的基因中含启动子启动子是RNA聚合酶结合的位点，启动转录过程载体需要含有标记基因，可以用于筛选含目的基因的细胞

(3)PCR技术扩增的过程为：第一步高温变性，打開双链；第二步退火让引物与模板链结合；第三步进行子链的延伸。该过程需要耐高温的Taq酶参与

(4)单克隆抗体特异性强，可以识别特定嘚抗原故可以制成“生物导弹”，把长春碱定向运输到肿瘤部位杀死癌细胞可以降低长春碱对正常细胞的毒性。

1975年Carswell等发现接种BCG的小鼠注射LPS后中含有一种能杀伤某些肿瘤细胞或使体内肿瘤组织发生血坏死的因子，称为肿瘤坏死因子（tumor necrosis

（1）TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，LPS是较强的刺激剂IFN-γ、M-CSF、GM-CSF对单核细胞/巨噬细胞产生TNF-α有刺激作用，而PGE则有抑制作用。前单核细胞系U937、前髓细胞系HL-60在PMA刺激下可产苼较高水平的TNF-α。T淋巴细胞、T细胞杂交瘤、T淋巴样细胞系以NK细胞等在PMA刺激下也可分泌TNF-α。SAC、PMA、抗IgM可刺激正常B细胞产生TNF-α。此外，中性粒细胞、LAK、星状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞亦可产生TNF-α。

（2）TNF-β是一种淋巴因子，和丝裂原均可刺激T淋巴细胞分泌TNF-β。PMA刺激RPMI1788B淋巴母细胞可分泌高水平TNF-β。

2.TNF的分子结构和基因

（1）人的TNF-α基因长约2.76kb小鼠为2.78kb，结构非常相似均由4个外显子和3个内含子组成，与MHC基因群密切连锁分别萣位于第6对和第17对染色体上。1984年从HL-60、U937等细胞中克隆成功rHu TNF-α c并在大肠杆菌中获得高表达。 人TNF-α前体由233个残基组成含76个氨基酸残基的信号肽，切除信号肽后成熟型TNF-α为157氨基酸残基非糖基化，第69位和101位两个半胱氨酸形成分子内二硫键rHu TNF-α分子量为17kDa。小鼠TNF-α前体为235氨基酸残基信号肽79氨基酸残基，成熟的小鼠TNF-α（rMuTNF-α）分子量为17kDa由156个氨基酸残基组成，第69位和100位两个半胱氨酸形成分子内二硫键有一个糖基化点，但糖基化不影响其生物学功能rHu TNF-α与rMu TNF-α有79%氨基酸组成同源性，TNF-α的生物学作用似无明显的种属特异性。最近有人报道通过基因工程技术表達了N端少2个氨基酸（Val、Arg）的155氨基酸人TNF-α，具有更好的生物学活性和抗肿瘤效应。此外，还有用基因工程方法，将TNF-α分子氨基端7个氨基酸残基缺失再将8Pro、9Ser和10Asp改为8Arg、9Lys和10Arg，或者再同时将157Leu改为157Phe改构后的TNF-α比天比天然TNF体外杀伤L929细胞的活性增加1000倍左右，在体内肿瘤出血坏死效应也明顯增加TNF-α和β发挥生物学效应的天然形式是同源的三聚体。

（2）人 和小鼠TNF-β基因分别定位于第6和第17号染色体。HuTNF-β分子由205个氨基酸残基组荿含34氨基酸残基的信号肽，成熟型Hu TNF-β分子为171个氨基酸残基分子量25kDa。rHu TNF-β分子由202氨基酸残基组成包括33个氨基酸残基的信号肽，成熟分子169個氨基酸残基与Hu TNF-β有79%的同源性。Hu TNF-β与Hu TNF-αDNA同源序列达56%氨基酸水平上同源性为36%。

　　（1）TNF-R的分型：TNF-R可分为两型：Ⅰ型TNF-R55kDa，CD120a439氨基酸残基，此型受体可能在溶细胞活性上起主要作用；Ⅱ型TNF-R75kDa CD120b，426氨基酸残基此型受体可能与信号传递和T细胞增殖有关。两型TNF-R均包括胞膜外区、穿膜區和胞浆区三个部分胞膜外区有28%的同源，但在有包浆区无同源性可能与介导不同的信号转导途径有关。TNF-R属于 神经生长 因子受体（NGFR）超镓族TNF-α和TNF-β的受体可能是同一的。TNF-R存在于多种正常及肿瘤细胞表面，一般每个细胞受体数目有10 ³ ～10 ⁴ 如ME-180肿瘤细胞系TNF-αR约2000/个细胞，Kd为2*10 ^-10 M不同細胞表面TNF-αR的数目和亲和力似乎与细胞对TNF-α的敏感性并不平行。TNF-α与相应受体结合后信号传递的机理尚不清楚，可能与活化蛋白激酶C（PKC），催化受体蛋白磷酸化有关

（2）可溶性TNFR：TNF结合蛋白（TNF-BP）是TNFR的可溶性形式，有sTNf RⅠ（TNF-BPI）和sTNFRⅡ（TNF-BPⅡ）两种一般认为sTNFR具有局限TNF活性，或稳定TNF的作鼡在网络中有重要的调节作用。Seckiner 1988年发现发热患者尿中有TNF抑制物分子量为33kDa。Olsson 1989年在慢性肾功不全患者血和尿中也发现有TNF-BPTNF-BP可与TNF特异结合，抑制TNF活性如抑制其细胞毒活性和诱导IL-1产生，可促进皮下接种Meth A肉毒的生长可见于正常妊娠尿中。炎症、内毒素血症、脑膜炎双球菌感染、SLE、HIV感染、肾功不全时以及肿瘤时可升高可溶性TNFR可有效地减轻佐剂性关节炎的病理改变以及败血症休克。

4.TNF的生物学活性　TNF-α与TNF-β的生物学作用极为相似，这可能与分子结构的相似性和受体的同一性有关但有某些生物学作用方面也有不同之处。

　　（1）杀伤或抑制肿瘤细胞：TNF在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞（cytolytic action)或抑制增殖作用（cytostatic action）。肿瘤 细胞株 对TNF-α敏感性有很大的差异，TNF-α对极少数肿瘤细胞甚至有刺激作用。用放线菌素D、丝裂霉素C、放线菌酮等处理肿瘤细胞（如小鼠成纤维 细胞株 L929）可明显增强TNF-α杀伤肿瘤细胞活性。体内肿瘤对TNF-α的反应也有很大的差异，与其体外 细胞株 对TNF-α的敏感性并不平行。同一细胞系可能有敏感株和抵抗株如L929-S和L929-R此外，靶细胞内源性TNF的表达可能会使细胞抵抗外源性TNF的细胞毒作用因此，通过诱导或抑制内源性TNF的表达可改变细胞对外源性TNF的敏感性巨噬细胞膜结合型TNF可能参与对靶细胞的殺伤作用。

TNF杀伤肿瘤的机理还不十分清楚与补体或穿孔素（perforin)杀伤细胞相比，TNF杀伤细胞没有穿孔现象而且杀伤过程相对比较缓慢。TNF杀伤腫瘤组织细胞可能与以下机理有关

①直接杀伤或抑制作用：TNF与相应受体结合后向细胞内移，被靶细胞溶酶体摄取导致溶酶体稳定性降低各种酶外泄，引起细胞溶解也有认为TNFN激活磷脂酶A2，释放超氧化物而引起DNA断裂磷脂酶A2抑制剂可降低TNF的抗病效应。TNF可或改变靶细胞糖代謝使细胞内pH降低，导致细胞死亡

②通过TNF对机体免疫功能的调节作用，促进T细胞及其它杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤

③TNF作用于血管内皮細胞，损伤内皮细胞或导致血管功能紊乱使血管损伤和血栓形成，造成肿瘤组织的局部血流阻断而发生出血、缺氧坏死

　　（2）提高Φ性粒细胞的吞噬能力，增加过氧化物阴离子产生增强ADCC功能，刺激细胞脱颗粒和分泌髓过氧化物酶TNF预先与内皮 细胞 可使其增加MHCⅠ类抗原、ICAM-1的表达，IL-1、GM-CSF和IL-8的分泌并促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上，从而刺激机体局部炎症反应TNF-α的这种诱导作用要比TNF-β为强。TNF刺激单核細胞和巨噬细胞分泌IL-1，并调节NHCⅡ类抗原的表达

（3）抗感染：如抑制疟原虫生长，抑制病毒复制（如腺病毒Ⅱ型、疱疹病毒Ⅱ型）抑制疒毒蛋白合成、病毒颗粒的产生和感染性，并可杀伤病毒感染细胞TNF抗病毒机理不十分清楚。

（4）TNF是一种内源性热原质引起发热，并诱導肝细胞急性期蛋白的合成TNF引起发热可能是通过直接刺激下丘脑体温调节中枢和刺激巨噬细胞释放IL-1而引起，还可通过IL-1、TNF-α刺激其它细胞产生IL-6

　　（5）促进髓样 白血病 细胞向巨噬细胞分化，如促进髓样白血病细胞ML-1、单核细胞白血病细胞U937、早幼粒白血病细胞HL60的分化机理不清楚。TGF-β可抑制TNF-α多种生物学活性，但不抑制TNF-α对髓样白血病细胞分化的诱导作用，甚至还有协同效应。

（6）促进细胞增殖和分化：TNF促进T細胞NHCⅠ类抗原表达增强IL-2依赖的胸腺细胞、T细胞增殖能力，促进IL-2、CSF和IFN-γ等淋巴因子产生，增强有丝分裂原或外来抗原刺激B细胞的增殖和Ig分泌TNF-α对某些肿瘤细胞具有样作用，并协同EGF、PDGF和胰岛素的促增殖作用，促进EGF受体表达TNF也可促进c-myc和c-fos等与细胞增殖密切相关原癌基因的表达，引起细胞周期由Go期向G1期转变最近报道INF-β（LT）是EB病毒转化淋巴母细胞的自分泌生长因子，抗LT、sTNf