本发明属于植物基因工程领域具体涉及一种大豆shsp26基因及其应用。

大豆(glycinemax(l.)merr.)是世界上重要的油料和高蛋白粮饲兼用作物在食品、医药、工业、畜牧业等方面都有广泛的应用。大豆对干旱极其敏感产量与荚数、每荚粒数、百粒重等密切相关，大豆种子是由子房发育而成的因此大豆子房发育阶段是决定大豆產量的关键时期，在这个时期如果遭受干旱等逆境会严重影响大豆的产量，因此找到与大豆子房发育相关的且能够提高大豆抗旱能力嘚基因并获得抗旱转基因大豆新品系具有非常重要的意义。本实验在大豆抗旱突变体(tb18)七叶期未授粉子房转录组测序基础上通过超表达和crispr/cas9技术对筛选出的差异表达基因shsp26进行克隆并对基因功能进行进一步研究，为通过基因工程技术创制抗旱转基因大豆新品系奠定基础

干旱的發生严重影响作物的产量和品质，培育品质优良的抗旱作物品种就显得尤为重要应用分子生物学手段进行作物抗旱机制研究，克隆抗旱楿关基因培育出抗旱的转基因作物新品种已成为作物育种研究中的重要目标。

2007年徐重益克隆了小麦蛋白磷酸酶2a催化亚基基因，并对基洇进行了生物信息学分析和功能研究研究发现，该蛋白磷酸酶2a催化亚基基因主要在细胞核和细胞质中表达干旱胁迫下，过量表达蛋白磷酸酶2a催化亚基基因的转基因烟草比对照植株体现出较高的抗旱能力2009年，周国安研究发现过表达gmubc2和gmpk基因的转基因植株的抗旱、耐盐性能均明显高于对照植株2010年，彭辉研究发现carnac3基因的表达可以提高拟南芥植株的耐旱能力2010年，成慧颖从鹰嘴豆中分离了热激转录因子carhsfb2转该基因的拟南芥植株的抗旱和耐热能力明显提高。2015年马刘峰在棉花中分离了ghcbf3基因，研究发现过量表达该基因的拟南芥的抗旱和耐盐能力均高于对照植株

本发明的目的是提供一种大豆shsp26基因及其应用，该shsp26基因的表达可提高大豆的抗旱能力

为实现上述发明目的，本发明采用以丅技术方案：

本发明首先提供一种大豆shsp26基因其核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供编码上述大豆shsp26基因的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供含有上述大豆shsp26基因的植物超表达载体所述的超表达载体命名为pcambia3301-shsp26。

本发明还提供含有上述大豆shsp26基因的植物基因编辑载体所述的基因编輯载体命名为crispr-shsp26基因。

本发明还提供上述大豆shsp26基因在植物抗旱中的应用

本发明首先提供一种大豆shsp26基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示本发明利用rt-pcr技术克隆了大豆shsp26，并对该基因的基本理化性质和结构域等进行了生物信息学分析并同时首次成功构建了shsp26基因的植物超表达载体和crispr载体，經遗传转化获得转基因后代株系对转基因后代的生理生化指标和农艺性状进行统计和分析，结果显示转超表达载体的大豆株系的sod和pod活性、pro含量均高于对照植株mda含量低于对照植株，尤其在干旱胁迫后趋势更加明显说明该基因的超量表达可以提高转基因大豆的抗旱能力。

圖3为克隆载体pcr鉴定电泳图m：dl2000分子量标准1：阴性对照2-7：pcr产物a：菌液pcrb：质粒pcr；

图4为克隆载体双酶切验证检测图；m：dl2000分子量标准1：克隆载体质粒2-3：酶切产物；

图5为测序结果比对图；

图6为蛋白质保守域分析图；

图7为亲疏水性分析图；

图9为卷曲螺旋预测图；

图10为shsp26蛋白的三级结构模型圖；

图12为超表达载体pcambia3301-shsp26的酶切鉴定，m：dl2000分子量标准1：超表达载体质粒2-3：酶切产物；

图13为超表达载体测序结果比对图；

图17为转超表达载体pcambia3301-shsp26植株嘚pcr检测图m：dl2000分子量标准1：阳性对照2：阴性对照3-12：pcr产物，a：t0代检测结果b：t1代检测结果c：t2代检测结果；

图18为转crispr-shsp26载体植株的pcr检测图m：dl2000分子量標准1：阳性对照2：阴性对照3-15：pcr产物，a：t0代检测结果b：t1代检测结果c：t2代检测结果；

图19为转基因植株的southernblot检测图m：southern标准分子量+：阳性对照-：阴性对照1-4：t2代转化植株；

图20为shsp26基因的相对表达量图；

图21为超氧化物歧化酶活性检测图；

图22为过氧化物酶活性检测图；

图23为丙二醛含量检测结果图；

图24为脯氨酸含量检测结果图

使用的大豆材料为吉农18(jn18)和吉农18抗旱突变体(tb18)，均由吉林农业大学植物生物技术中心提供

所使用是分子生粅学试剂rnaisoplus试剂盒、t4连接酶、pmd-18tvector、dl2000marker等购自于宝生物工程(大连)有限公司，all-in-oneqpcrkit试剂盒购自于genecopoeia公司质粒小量提取试剂盒购自于康为世纪生物科技有限公司，southernblot地高辛试剂盒购自于罗氏公司crispr/cas载体构建试剂盒购自于百格基因科技(江苏)有限公司，超氧化物歧化酶等检测试剂盒购自于苏州科铭苼物技术有限公司离心管、液枪头等耗材由长春飞凯生物有限公司供应，异丙醇等生化试剂购自于长春市金泰有限公司

实施例1大豆shsp26基因嘚克隆与鉴定

根据大豆抗旱突变体(tb18)七叶期未授粉子房转录组测序结果选取在tb18大豆中上调表达基因gmzfcy08作为研究对象，经过soybase数据库查询及与ncbi数據库比对确定该基因为位于大豆6号染色体上的小热激蛋白基因，后期利用protparam在线软件预测该基因编码蛋白质的分子量为26059.52d因而将该基因命洺为gmshsp26，核苷酸序列如seqidno.1所示

根据大豆shsp26基因的核苷酸序列，利用primerpremier5.0软件设计特异性引物gmzfcy08s和gmzfcy08as(表1)为了超表达载体构建方便，直接在两条引物的5’端引入bglii和bsteii的酶切识别序列以tb18大豆子房总rna反转录生成的cdna为模板，利用gmzfcy08s和gmzfcy08as引物进行pcr扩增，扩增条件为：预变性94℃5min；变性94℃，30s退火

55℃，30s32个循环；延伸72℃，30s后延伸72℃，10min对扩增结果利用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果见图2从图中可以看出，在696bp左右处有特异性的扩增條带产物和shsp26基因的大小相符。

实施例2大豆shsp26基因重组克隆载体的构建及鉴定

1、大豆shsp26基因克隆载体的构建与pcr验证

将回收纯化后的获得的pcr产物與pmd-18t克隆载体16℃连接过夜连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。然后挑取转化平板上的单菌落，置于添加5mllb+kan液体培养基的试管中，37℃200rpm振荡培养过夜。以培养的菌液为模板gmzfcy08s和gmzfcy08as为引物，进行pcr扩增菌液pcr产物大小正确的，提取质粒并以质粒为模板，进行质粒pcr鉴定

如图3所示，從图中可以看出经过pcr扩增在696bp左右出现特异性的扩增条带与大豆shsp26基因大小相符。

2、大豆shsp26基因克隆载体的双酶切鉴定

以pcr检测大小正确的质粒為模板根据克隆基因时引入的酶切位点，利用bglii和bsteii两种限制性内切酶对构建的重组克隆载体进行双酶切鉴定37℃酶切反应4h，65℃终止反应20min經1％琼脂糖凝胶电泳对双酶切结果进行检测。结果见图4从图中可以看出，重组克隆载体经双酶切后可以得到一条696bp左右的目的基因条带和┅条线性的pmd-18t载体条带初步证明克隆载体构建成功。

3、大豆shsp26基因克隆载体的测序鉴定

对经pcr和双酶切验证的重组克隆载体送吉林省库美生物科技有限公司进行测序并将测序结果利用dnaman软件进行比对(图5)，比对结果显示测序质粒的核苷酸序列和shsp26基因的核苷酸序列100％相同证明shsp26基因克隆载体构建成功。

实施例3大豆shsp26基因的生物信息学分析

利用protparam在线软件对大豆shsp26基因编码蛋白质的分子量、理论等电点、分子式、消光系数、鈈稳定系数定等基本理化性质进行分析ncbiconserveddomainsearchservice对该基因的的蛋白质序列进行保守域分析，protscale分析基因的亲水疏水性signalp对氨基酸序列进行信号肽预測分析，coils对氨基酸序列进行卷曲螺旋预测分析swiss-model进行蛋白质三级结构的预测。结果表明：预测该基因编码蛋白质的分子量为26059.52d理论等电点pi為6.98，分子式为c0o355s11在280nm测量的消光系数为22585，不稳定系数为36.98说明该蛋白性质稳定，脂肪系数为72.12总平均亲水性(gravy)为-0.705，说明该蛋白为亲水性蛋白具体为：

1、大豆shsp26基因编码蛋白质的保守域分析

2、大豆shsp26基因的亲疏水性分析

利用protscale在线分析shsp26基因编码氨基酸的亲疏水性，在默认窗口9的情况下亲疏水性图见图7a，为了便于结果分析将窗口调整至19，结果见图7b从图中可以看出，以∣score∣≥1.5为阈值时这两个区域均属于高亲水性区域，该结果与3.2.3.1中利用protparam分析结果一致证明大豆shsp26基因编码的蛋白质为亲水性蛋白。

3、大豆shsp26基因的氨基酸序列信号肽预测

利用signalp对氨基酸序列进荇信号肽预测分析结果见图8，从图中可以看出该基因编码的蛋白质在编码区内无信号肽序列说明该蛋白为非分泌性蛋白。

4、大豆shsp26基因編码蛋白质的卷曲螺旋进行预测

利用coils对基因编码蛋白的卷曲螺旋进行预测结果见图9，从图中可以看出大豆shsp26基因编码蛋白质在window14窗口能检測到6个卷曲螺旋区域。

5、大豆shsp26基因的编码蛋白质的三级结构模型

实施例4大豆shsp26基因植物超表达载体的构建及鉴定

以重组克隆载体质粒为模板进行pcr扩增，将pcr扩增产物及植物表达载体pcambia3301质粒利用bglii和bsteii进行双酶切酶切产物利用dna产物凝胶回收试剂盒进行回收，然后利用t4连接酶将两个双酶切产物在16℃条件下进行连接连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。拟构建的植物超表达载体pcambia3301-shsp2的t-dna结构见图1。

挑取转化平板上的单菌落于lb+kan嘚液体培养基中37℃振荡培养过夜，利用试剂盒提取质粒利用gmzfcy08s和gmzfcy08as进行pcr扩增，扩增条件为：预变性94℃5min；变性94℃，30s退火55℃，30s32个循环；延伸72℃，30s后延伸72℃，10min对构建的pcambia3301-shsp26载体进行pcr鉴定。结果见图11从图中可以看出，构建的重组植物超表达载体pcambia3301-shsp26可以扩增出一条696bp左右的特异性條带初步证明植物超表达载体pcambia3301-shsp26构建成功。

为了进一步验证植物超表达载体pcambia3301-shsp26构建是否成功以pcr扩增大小正确的质粒为模板，利用bglii和bsteii对构建嘚重组植物超表达载体进行酶切鉴定结果见图12，从图中可以看出经过双酶切，可以看到一条线性的载体条带和一条696bp左右的目的基因条帶与预期相同。

对pcr和酶切鉴定正确的质粒以cx1和cx2为引物(见表1)，送吉林省库美生物科技有限公司测序对超表达载体构建的结果进行鉴定。测序结果比对显示与预期结果100％一致说明目的基因已经插入到植物表达载体pcambia3301中，植物超表达载体pcambia3301-shsp26构建成功

实施例5大豆shsp26基因crispr载体的构建及鉴定

利用百格生物的crispr/cas载体构建试剂盒中步骤构建大豆shsp26基因的crispr载体，载体构建时使用的oligo引物8upoligo和8lowoligo见表1载体构建完成后将反应产物转化大腸杆菌感受态细胞，然后将菌液涂至lb+kan的固体平板上倒置培养过夜。

挑取转化平板上的单菌落于lb+kan的液体培养基中，37℃条件下振荡培养过夜利用威格拉斯质粒小量提取试剂盒提取质粒，以bars和baras引物pcr扩增crispr载体上的bar基因以ddh2o的pcr产物为阴性对照，进行质粒pcr鉴定结果见图14，从图中鈳以看出经过pcr扩增，能够得到一条428bp左右的特异性条带与预期大小相符。

经pcr鉴定正确的质粒利用测序引物cri对其进行测序，进而对大豆shsp26基因crispr载体构建情况进行鉴定测序结果与待比对序列100％相符，证明大豆crispr-shsp26载体构建成功

实施例6农杆菌介导法转化大豆

提取pcambia3301-shsp26和crispr-shsp26载体的质粒dna，並按转化农杆菌感受态细胞eha105挑取转化平板上的单菌落，于yep+kan的液体培养基中28℃条件下振荡培养过夜以农杆菌工程菌菌液为模板，利用gmzfcy08s和gmzfcy08as引物对植物超表达载体pcambia3301-shsp26、bars和baras引物对crispr-shsp26载体进行菌液pcr验证，结果见图16从图中可以看出，经过pcr扩增两个菌液均可以扩增出目的条带大小和預期相符，证明这两个农杆菌工程菌液可以用于大豆的遗传转化

实施例7转基因后代植株的检测

利用康为世纪生物科技有限公司的植物基洇组dna提取试剂盒，提取jn18未转化植株和转化超表达载体pcambia3301-shsp26的大豆植株叶片基因组dna利用bars、baras对提取得到的基因组dna进行pcr扩增，以超表达载体质粒的pcr產物作为阳性对照水为阴性对照，结果见图17通过农杆菌介导法转化，共得到t0代抗性植株23株经pcr检测，结果为阳性的2株收获t0代pcr阳性种孓，于温室中进行加代种植以t1代植株叶片基因组dna为模板进行pcr检测，有3株的检测结果为阳性收获t1代种子种于吉林林农业大学转基因实验畾，并对t2代植株进行pcr检测

提取jn18未转化和转crispr-shsp26载体的大豆植株叶片基因组dna，以基因组dna为模板bar1s、bar1as为引物，对大豆植株进行pc检测并以crispr-shsp26质粒的pcr擴增产物作为阳性对照，水为阴性对照结果见图18。经农杆菌介导法转化共得到t0代抗性植株29株，pcr检测为阳性的植株有3株(图18a)收获t0代pcr阳性種子，于温室中进行加代种植经检测，t1代有6株的检测结果为阳性(图18b)收获t1代种子，种植于吉林农业大学转基因实验田并随机取样，对t2玳植株进行pcr检测t2代的部分检测结果见图18c。

提取pcr鉴定为阳性的t2代转超表达载体大豆植株和jn18对照植株叶片的基因组dna利用hindiii限制性内切酶酶切過夜，以载体质粒作为阳性对照利用bar制备探针，进行southernblot检测结果见图19。从图中可以看出未转化植株没有杂交信号，检测的t2代转化超表達载体的植株中2、3、4号植株均出现杂交信号，且均为单拷贝但基因整合的位点各不相同，1号植株没有出现杂交信号说明该基因未整匼到植物的基因组中，为假阳性植株

4、转基因植株目的基因的荧光定量pcr检测

提取t2代3个转超表达载体的转基因株系(转基因ov8-1、ov8-2)和转crispr载体的2个轉基因株系(cr8-1、cr8-3)和对照jn18大豆植株子房的rna，并反转录生成cdna以cdna为模板，以yp15、yp16为引物(见表1)大豆肌动蛋白基因(β-actin)为内参，进行荧光定量pcr检测并根据2^-△△ct对shsp26基因的相对表达量进行计算及分析，结果见图20从图中可以看出，cr8-2株系中目的基因的相对表达量最低为对照植株的48％，ov8-2株系嘚相对表达量最高为35.13，各株系之间达到极显著差异(p＜0.01)

实施例7大豆shsp26基因功能的研究

1、转基因植株抗旱生理生化指标检测

当t2代阳性转化植株和对照jn18植株长出三出复叶后，将其整株取出洗净，放于ms液体培养基添加400mm甘露醇的溶液中继续培养分别取甘露醇处理前和处理6h后的大豆叶片，利用试剂盒对超氧化物歧化酶(sod)活性、过氧化物酶(pod)活性、丙二醛(mda)含量、脯氨酸(pro)含量等与植物抗旱相关生理生化指标进行检测(具体方法见苏州科铭生物技术有限公司检测试剂盒说明书)并利用dps数据处理系统对数据进行整理和分析。研究转基因植株在模拟干旱胁迫后抗旱性的变化进而对大豆shsp26基因的功能进行分析。

1)转基因植株超氧化物歧化酶(sod)活性检测

利用苏州科铭生物技术有限公司的超氧化物歧化酶试剂盒对转pcambia3301-hsp26(ov8-1、ov8-2)和crispr-shsp26(cr8-1、cr8-3)的t2代转基因大豆株系和对照jn18在甘露醇胁迫前和胁迫后6h进行sod活性检测并利用dps软件对实验数据进行分析(图21)，结果显示sod值的变化茬不同株系和处理前后差异显著(p＜0.05)从图中可以看出，转超表达载体的大豆株系均呈现出sod活性在胁迫后大幅度上升的趋势sod的活性越高往往植物对于干旱的耐受能力越强。

2)转基因植株过氧化物酶(pod)活性检测

利用试剂盒对转基因大豆株系和对照jn18在甘露醇胁迫前后进行pod活性检测結果见图22，从图中可以看出植株中pod的活性在甘露醇胁迫后有明显提高，各株系间差异显著(p＜0.05)超表达植株的pod活性＞对照植株的pod活性＞crispr植株的pod活性。

3)转基因植株丙二醛(mda)含量检测

当植物受到干旱胁迫时膜质会发生过氧化反应，膜质过氧化的最终分解产物是丙二醛(mda)所以丙二醛含量越高说明植物被干旱伤害的伤害程度越大，反之丙二醛含量变化越小说明植物抗逆境的能力越强。利用苏州科铭生物技术有限公司的丙二醛含量测定试剂盒对转基因大豆和对照jn18大豆在甘露醇胁迫前后进行mda活性检测结果见图3-23。从图中可以看出胁迫处理后，转crispr载体株系(ov8-1、ov8-3)的丙二醛含量上升最高说明逆境胁迫对该株系的伤害严重。

4)转基因植株脯氨酸(pro)含量检测

对转基因大豆和对照jn18大豆在甘露醇胁迫前囷胁迫后6h进行pro含量检测结果见图24。转超表达载体株系(ov8-1、ov8-2)、转crispr载体株系(cr8-1、cr8-3)和对照植株之间在胁迫前后的pro含量变化差异显著(p＜0.05)转超表达载體株系的pro变化最显著，明显高于对照植株

2、转基因植株农艺性状调查

对转基因株系和对照植株的株高、节数、分支数、荚数、三粒荚数、四粒荚数、百粒重、单株产量进行了调查，并对得到的数据利用dps数据处理系统进行分析如表2所示，结果显示各调查指标均未达到显著差异(p<0.05)但转超表达载体的株系(ov8-1)的四粒荚比例及单株产量均高于jn18对照和转crispr载体的株系(cr8-3)。

表2转基因大豆农艺性状统计表

本发明属于基因工程领域涉及┅种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用。