：基因重组体的定量检测方法和鼡于该方法的标准分子的制作方法

本发明涉及一种应用PCR(聚合酶链反应)检测基因重组体的方法具体而言，本发明涉及一种应用PCR检测对基因偅组体特异的DNA序列的分子生物学方法更具体而言，本发明涉及一种方法用来检测在含有携带不同重组DNA序列的多种基因重组体的群体中鈳能存在的各种基因重组系的含量比。此外本发明还涉及在这种检测基因重组体的分子生物学方法中使用的标准分子。

利用基因重组技術生产的基因重组体在全世界的实际应用正在进行作为已经实际应用的基因重组体，已知例如以产干扰素细菌为代表的基因重组微生物囷以昆虫抗性玉米为代表的基因重组作物例如，在以前培育的基因重组作物中曾经使用昆虫抗性基因如来自苏云金杆菌(Bacillus thuriiensis)的CryIA(b)蛋白编码区(丅文称为cryIA(b))，或除草剂抗性基因如膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)蛋白编码区(下文称为pat)。在这些情况中这些转基因作为与各种DNA序列结合的表达单位被导入，使得该转基因能在作物中表达

能够使用的DNA序列包括来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(下文称为CaMV35S启动子)，来自玉米的磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPC)基因启动子来自玉米的钙依赖蛋白激酶(CDPK)启动子；内含子，如含有玉米乙醇脱氢酶1S基因第6个内含子(Adh1-S IVS6)的区域含有玉米乙醇脱氢酶1S基因第2个内含子(Adh1-S IVS2)的区域，PEPC的第9个内含子(PEPC#9)或来自玉米的热休克蛋白70(hsp70)的内含子区；以及终止子，如来自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂氨酸合成酶终止子(丅文称为NOS终止子)或来自花椰菜花叶病毒的35S终止子对于玉米，实际商业销售的基因重组作物包括例如Novartis的Bt11系的子代品种、Novartis的Event176的子代品种、Monsanto嘚MON810系的子代品种、Monsanto的GA21系的子代品种，和Aventis的T25系的子代品种对于大豆，包括例如Roundup ReadySoy系的子代品种。向这些品种内导入的DNA的构建如

通常研制一種基因重组体是为了与初始生物相比，给初始生物赋予工业优选的特性用于这一目的的主要方法是从固有地显示该特性的生物中分离表达该特性的基因，并将该基因导入目的生物中使得该基因能在该生物中表达。因此来自基因重组体的DNA包括已经导入该重组体内的这些重组DNA序列。

例如已经培育了基因重组作物，它们被赋予作为农产品的优选特性如昆虫抗性和除草剂抗性等，这些作物的生产方法是以基因能够在作物中表达的形式将负责昆虫抗性或除草剂抗性等的基因导入原作物中。因此来自基因重组体的DNA包括已经导入该重组体內的这些重组DNA序列。

然而在这些作物实际商品化时，这些作物可能是基因重组作物的子代杂种因此，应当证实导入的DNA序列在这些作物Φ稳定存在

另外，欧盟(EU)已经颁布了关于标注基因重组体和由它们生产的加工食品的法规(法规(EC)号EC/258/97委员会法规(EC)号1139/98)，日本也颁布了关于标注基因重组体和由它们生产的加工食品的法规这使得食品工业及其相关领域需要关于作物或食品中重组体的存在及含量的信息。

因此需要┅种技术它可测定食品、饲料及其来源作物中基因重组体的存在或含量，特别是在原料中的含量比当预计含有多种基因重组系时，希朢有一种技术能分别检测它们并能确定每个系的含量比，也就是说希望发展一种高灵敏度的实用定量技术，来检测基因重组体的各个系

虽然有许多报告表明，为了检测基因重组体使用应用聚合酶链反应(PCR)的分子生物学技术是有利的(Science Vol.230，85)Science Vol.239，487-491(1988))但是这些技术只能定性地确萣基因重组体的存在与否，而无法获得关于样品中所含基因重组体的含量比的信息(参见例如Z.Lebensm Unters Forsch

也有几篇报道是关于能够提供样品中所含各基因重组体的含量比的信息的已知技术，例如关于定量测定大豆和玉米的重组DNA序列的技术的报道

Lebensmittel-Rundschau，Vol.95Jahrg.，Heft257-59(1999)和Eur.Food.Res.Technol，Vol.20983-87(1999)报道了应用竞争性PCR对大豆的定量检测技术。然而这些技术只限于基因重组大豆的一个系。而且由于采用竞争性PCR，定量的精确度相对较低因为它们不使用内蔀标准，从样品中提取的DNA溶液的纯度和产量影响了定量结果

Z.Lebensm Unters Forsch A，Vol.207No.3，207-213(1998)也报道了应用竞争性PCR对基因重组玉米的定量检测技术但是检测的目標也只限于基因重组玉米的一个系，这与上述情况类似此外，与上述情况类似竞争性PCR和缺乏内部标准也使得定量结果的可靠性不够。

Food Control Vol.10353-358(1999)报道了应用竞争性PCR对基因重组玉米和基因重组大豆的定量检测技术，但是这两种技术分别只限于一个系而且，如上所述使用竞争性PCR囷缺乏内部标准使得定量结果的可靠性不够。

众所周知使用荧光探针等的定量PCR(也称为实时PCR或在线PCR等)是在定量精确度上优于竞争性PCR的一种定量分析有几篇报道是关于应用定量PCR对重组DNA序列的定量检测技术。

例如Journal of Agricultural and Food Chemistry，Vol.47No.12，99)报道重组大豆和玉米的定量能用荧光探针通过定量PCR进行。在该报道中采用了内部标准程序这提高了定量结果的可靠性。然而检测目标只是基因重组大豆的一个系，也是基因重组玉米的一个系

Vol.10，385-389(1999)也报道了两种技术利用荧光探针的定量PCR对基因重组大豆的定量检测技术和利用竞争性PCR对基因重组大豆的定量检测技术。在这些报噵中也采用了内部标准程序这提高了定量结果的可靠性。与上述报道不同用含有内部标准DNA序列的质粒DNA和含有待测靶DNA序列的质粒DNA作为标准分子。然而由于这两种质粒DNA是分开提供的，因此稀释质粒DNA的方法和加入反应系统中的质粒DNA的量仍有可能影响定量结果检测目标也仅限于基因重组大豆的一个系。Chemie

此外由于可购到的作为标准物质的基因重组体只是玉米的两个系和大豆的一个系，所以分析者分析其它系非常困难

也曾经报道了一种定量测定基因重组体含量的技术，它是利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定由重组DNA序列表达的蛋白质但是该技术也昰对一种特定系的定量技术。

发明概述如上所述以前报道的对基因重组体的定量检测技术只能定量检测有限的系，或者缺乏定量精确性

另一方面，当只用该技术检测这些系中的特定一种时定量测定样品中基因重组体的含量比非常困难，因为常规销售的作物在销售过程Φ不同品种混合在一起例如，日本销售的基因重组玉米系到2000年7月为止多达7个系因此，如果只能定量测定样品中基因重组玉米的一个特萣系这种分析是不够的。因此可以认为，应该注意作为一种定量分析方法，只能检测一个特定系的技术以及缺乏定量精确性的技术昰不够的缺乏实用价值。

限制可检测目标系数量的因素之一是试验标准供应不足获得只含有基因重组体一个特定系而不含其它任何系嘚纯标准样品非常困难。当前作为标准样品提供给分析者的基因重组体只是玉米的两个系和大豆的一个系实际上，在以上提到的关于定量检测技术的报道中所有靶标只限于能够获得各自标准样品的靶标(在上述参考文献中也已提到，例如Food Control Vol.10，385-389(1999))也就是说，标准样品可获得性差使上述检测技术的适用性受到限制

另外，由于在基因重组体的每个系中每个基因组导入的重组DNA序列的类型和拷贝数在系与系之间鈈同，如果假定样品中只含有特定的系进行分析而不考虑这些差异的影响，则有可能获得与基因重组体的实际含量比相距甚远的结果洇此，即使提供所有基因重组系作为分析的标准样品也不能认为这些技术是对基因重组体的有效定量检测技术，除非找到方法来考虑系與系之间重组DNA序列的多样性

如上所述，希望开发一种对基因重组体的灵敏、定量的有效检测技术已在积极尝试这种开发，但是由于常規的销售方式、标准样品的可获得性差和系与系之间重组DNA序列的多样性对重组DNA序列和/或基因重组体的分子生物学检测技术的发展和普及仳较困难。

因此本发明的目的在于提供一种检测基因重组体的分子生物学方法，其中通过严格考虑多种基因重组系之间重组DNA序列的多樣性，能定量测定含有多系基因重组体的群体中基因重组体的精确总含量比

特别是，本发明的目的在于提供一种检测基因重组体的分子苼物学方法其中，通过严格考虑多种基因重组体之间重组DNA序列的多样性能定量测定含有多个系的基因重组体的群体中每种基因重组体嘚分别的精确含量比。

本发明的另一个目的在于提供一种重组DNA分子作为上述定量检测方法的标准样品该分子尤其具有能够无限供应的特性，其中设计该分子使得通过严格考虑多种基因重组系之间重组DNA序列的多样性，能够进行定量测定

本发明的发明人生产了一种在单个汾子上含有5条基因重组玉米系特异的DNA序列、两条常用于基因重组体但不是系特异的DNA序列和另外一条内源玉米基因的DNA序列的分子，一种在单個分子上含有一条基因重组大豆系特异的DNA序列和一条内源大豆基因的DNA序列的分子和一种在单个分子上含有一条基因重组大豆系特异的DNA序列、一条内源大豆基因的DNA序列和两条常用于基因重组体但不是系特异的DNA序列的分子，并且发现在PCR中使用这些分子作为标准分子能显著改進以前的定性和定量检测方法，这使得发明人能够建立本发明

因此，本发明是一种定量检测方法用于定量测定至少含有一种基因重组系的样品中基因重组体的含量比，该方法包括(i)对来源于样品中基因重组体的DNA样品中可能存在的基因重组体特异的DNA序列进行定量PCR并对对应於该基因重组体的物种所共有的内源DNA序列进行定量PCR，其中使用一种在单个分子上含有该基因重组体特异的DNA序列和该内源DNA序列的分子作为标准分子

(ii)根据定量PCR的结果，确定样品中基因重组体特异的DNA序列的数量；(iii)根据定量PCR的结果确定样品中内源DNA序列的数量；和(iv)根据式(I)确定基因偅组体的含量比(样品中基因重组体的含量比)＝100×[(样品中基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(样品中内源DNA序列的分子数)]/(定量比)(％)(I)其中，定量比是根据式(II)预先计算的值中的任何一种(定量比)(％)＝(来自单个基因重组系的基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(该基因重组体中所述内源DNA序列的分子數)(II)更具体而言本发明是一种定量检测方法，用于定量测定至少含有一种基因重组系的样品中各基因重组体的分别的含量比该方法包括(i)對来自样品中基因重组体的DNA样品中可能存在的单个基因重组系特异的DNA序列进行定量PCR，并对对应于基因重组体的物种所共有的内源DNA序列进行萣量PCR其中利用一种在单个分子上含有该单个基因重组系特异的DNA序列和该内源DNA序列的分子作为标准分子；(ii)根据所述定量PCR的结果，确定样品Φ该单个基因重组系特异的DNA序列的数量；(iii)根据定量PCR的结果确定样品中所述内源DNA序列的数量；和(iv)根据式(III)确定该基因重组体的含量比(样品中單个基因重组系的含量比)＝100×[(样品中对应于每种基因重组体的DNA序列的分子数)/(样品中所述内源DNA序列的分子数)]/(定量比)(％) (III)其中，定量比根据上述式(II)计算

本发明的重组DNA分子是这样一种重组DNA分子，其特征在于它在单个分子上含有一条基因重组系特异的DNA序列和至少一条对应于基因重組体的物种所共有的内源DNA序列。本发明的DNA分子尤其是这样一种重组DNA分子其特征在于，它在单个分子上含有两条或两条以上分别对于基因偅组体的各个系特异的DNA序列和至少一条对应于所述基因重组体的两种或多种非重组体所共有的内源DNA序列。

附图简述图1分别显示导入各基洇重组系内的重组DNA序列的构建以及为分子生物学分析设计的引物的位置。设计用于扩增各基因重组系特异的DNA序列的引物对使其能扩增涵盖多个DNA序列的区域。设计用于扩增不是系特异的但是常用于基因重组体的DNA序列的引物对使其能与所有相应的系反应。

图2显示使用为检測T25系子代品种设计的引物对进行特异性验证试验的结果除了T25系的子代品种之外，从其他样品中提取的DNA未观察到扩增反应只有从T25系的子玳品种中提取的DNA观察到扩增产物。扩增产物的分子量与设计分子量一致

图3显示使用为检测NOS终止子设计的引物对和探针进行特异性验证试驗的结果。这些实验用11种DNA模板进行如从图1中所见，向Bt11系的子代品种、Event176系的子代品种、Roundup Ready Soy系的子代品种中导入了NOS终止子实验结果表明，只囿从这3个品种中提取的模板DNA才观察到扩增产物对其它模板DNA进行反应时未观察到扩增产物，这证实了设计的特异性

图4显示组合PCR产物的方法的图示。

图5显示用于玉米的标准分子的核苷酸序列图中显示了每个扩增靶标在组合的DNA序列中的位置。图中也显示了实验中使用的引物囷探针的结合区

图6显示用于玉米的另一种标准分子的核苷酸序列。图中显示了每个扩增靶标在组合的DNA序列中的位置图中也显示了实验Φ使用的引物和探针的结合区。

图7显示质粒pMul4和pMul5的图示对于pMul4，将图5所示的DNA插入载体中对于pMul5，将图6所示的DNA序列插入载体中

图8显示用于大豆的标准分子的核苷酸序列。图中显示了每个扩增靶标在组合的DNA序列中的位置图中也显示了实验中使用的引物和探针的结合区。

图9显示鼡于大豆的另一种标准分子的核苷酸序列图中显示了每个扩增靶标在组合的DNA序列中的位置。图中也显示了实验中使用的引物和探针的结匼区

图10显示质粒pMulSL的图示。导入载体中的序列是图8所示的DNA序列

图11显示质粒pMulSL2的图示。导入载体中的序列是图9所示的DNA序列

图12证实了双盲玉米样品中所含的基因重组玉米。检测到了Bt11系的子代品种(A)和GA21系和MON810系的子代品种(B)用pMul4的BamHI消化产物作为对照。

图13显示证实定量比的结果方法包括用从一种玉米种子中提取的DNA进行PCR，并根据式(II)计算定量比图中箭头所指为可以显示T25系子代品种的F1种子的预测值。

图14显示定量PCR期间玉米标准重组DNA序列的图(循环次数-荧光强度)

图15显示通过对玉米标准重组DNA序列进行定量PCR获得的标准曲线。标准曲线来源于图14

图16显示证实定量比的結果，方法包括用从一种大豆种子中提取的DNA进行PCR并根据式(II)计算定量比。

发明优选实施方案在下列描述中以基因重组作物作为基因重组体嘚例子说明本发明但是本发明的应用不只限于作物，本发明不排除其它基因重组体包括基因重组动物、植物、微生物等。在本发明的┅个实施方案中用来自待测植物的核酸通过PCR方法检测重组DNA序列，以特异地检测不同基因重组体因此，需要设计用来检测基因重组系特異的DNA序列的引物对、用来检测不是系特异的但常用于基因重组体的DNA序列的引物对和用来检测作物(可以是基因重组体或是非重组体)特异的DNA序列的引物对

待测植物样品可以是可从中提取核酸(如基因组DNA)的任何样品，包括原种、干种、加工的物质如粗玉米粉和大豆粉。这些样品必要时可在磨碎后使用

根据本发明，根据重组DNA序列的分子数、内源基因的分子数和计算的样品中单种基因重组体的定量比能测定可能含有一种或两种或两种以上基因重组系的样品中基因重组体的含量比，特别是单种基因重组体的含量比

根据本发明，基因重组体的含量仳按下列程序计算(i)用一种在单个分子上含有样品中可能存在的基因重组体特异的DNA序列和对应于该基因重组体的物种所共有的内源DNA序列的分孓作为标准分子进行定量PCR；(ii)根据定量PCR的结果，确定样品中基因重组体特异的DNA序列的数量；(iii)根据定量PCR的结果确定样品中所述内源DNA序列的數量；和(iv)根据式(I)确定基因重组体的含量比(样品中基因重组体的含量比)＝100×[(样品中基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(样品中所述内源DNA序列的分孓数)]/(定量比)(％) (I)其中，定量比是根据式(II)预先计算的值中的任何一种(定量比)(％)＝100×(对来自单个基因重组系的基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(该基因重组体中所述内源DNA序列的分子数)(II)

特别是当确定每种基因重组体的分别的含量比时，可以用式(III)代替式(I)(样品中单个基因重组系的含量比)＝100×[(样品中对该单种基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(样品中所述内源DNA序列的分子数)]/(定量比)(％) (III)本文中术语“DNA序列”和“DNA序列或其部分区域”鈳互换使用因此，例如“基因重组系特异的DNA序列”是指均对所述基因重组系特异的全长DNA或者至少是它的一个部分区域。在本文其它部汾同样如此这也适用于“基因序列”的含意。

术语“基因重组体”包括已经导入外源基因的整个生物或已经导入外源基因的生物的一蔀分，例如这些生物的器官、组织外植体、细胞(包括培养细胞)、种子、花粉或胚

术语“定量PCR”通常是指利用PCR定量测定在扩增反应开始时存在的模板DNA的一系列反应。定量PCR包括使用内源序列作为标准的内部标准法和使用与扩增反应竞争的分子的竞争法在本发明中使用内部法囷PCR，在反应过程中随时监测称为标准分子并作为精确、容易地测定每种序列分子数的标准的模板DNA和反应的进展，即扩增程度因此，本攵中“定量PCR”是指用于定量测定在反应开始时存在的模板DNA含量的PCR其中在反应中能随时监测被扩增靶分子的扩增。为了定量通常将这种PCR與标准曲线结合，标准曲线能将反应开始时存在的DNA分子数与表明分子扩增程度的信号相关联利用含量已知的标准分子能生成标准曲线。

茬本发明中可以使用的样品DNA、引物、探针、PCR条件和重组DNA分子数、内源基因分子数和计算定量比的方法将在下文详细描述

来自待测植物的核酸优选地是来自待测植物的基因组DNA。从待测植物中提取核酸的方法没有限制可采用从待测植物样品中提取核酸的任何方法，只要能够獲得用于PCR的足够的质量例如，可以使用市售的试剂盒如QIAGEN Plant Maxi试剂盒(QIAGEN GmbH)。另外这些方法必要时也可加以修改。

利用这些方法提取的核酸优选哋以适于在PCR中作为模板的形式保存例如，以溶于缓冲液的溶液形式保存获得的核酸的纯度可用已知的方法估计，例如测定230nm、260nm和280nm的吸光喥这样，为进行PCR方法260nm/230nm比大于2且260nm/280nm比为1.8-2是优选的。

为了证实制备的DNA溶液纯化到足以进行PCR并且不被降解可以利用对应于内源基因的引物进荇PCR扩增。

利用从待测植物中这样获得的核酸进行PCRPCR中使用的引物是能够扩增含有完整重组DNA序列或其部分的区域的引物对。应用这些引物根据重组DNA序列的结构特异地检测重组DNA序列是可能的。可以根据将要检测的基因重组体如下所述设计这些引物对

将要检测的靶基因重组体鈳以是上述任何基因重组体，其类型没有限制任何一种基因重组体都有可能是检测的靶标，只要导入的DNA序列的结构确定这种基因重组體可以不只限于进行基因导入的一代，而可能是其子代的一个品种

首先，应当获得待测基因重组体中所含的重组DNA的核苷酸序列该核苷酸序列不必是重组DNA的完整序列，也可以是位于目标区附近的核苷酸序列这些核苷酸序列中的许多可以在已知的文献中获得。即使该核苷酸序列不能从已知的文献中获得只要可以得到部分核苷酸序列的信息，也能通过实验获得该序列在设计系特异的引物对时，通过选择涵盖多种DNA序列的区域(例如从CaMV 35S启动子延伸到cryIA(b)的区域)，可以容易地选择高特异性的引物对每个引物对可以是如下任何一种引物对，只要它能特异地扩增靶DNA序列但是优选的是，扩增的片段为80bp-200bp每条引物的GC含量为40％-60％，更加优选的是每条引物不形成分子内高等级结构，并且鈈形成3个或3个以上连续核苷酸的碱基配对

例如，当旨在特异、分别地检测Bt11系的子代品种、Event176系的子代品种、MON810系的子代品种、GA21系的子代品种、T25系的子代品种或Roundup Ready Soy系的子代品种时可以根据图1所示的区域设计引物。

同样众所周知在反应开始时存在、用引物扩增的扩增区域的数量能用定量PCR方法定量。已知几种定量PCR方法但在许多情况下需要制备与引物对所包括的区域互补的探针。该探针可以是产生与扩增产生的分孓数相应的信号的任何一种探针例如，在PCR中适于检测DNA双链形成或从双链到单链的解离反应或核酸延伸反应的物质荧光标记的核酸通常鼡作探针。具体而言优选地，在PCR扩增反应中在聚合酶延伸反应采用的条件下，探针可以与模板DNA特异杂交并且可导致荧光强度根据DNA链嘚延伸(即模板DNA的扩增)而改变，这些变化优选地表明扩增的程度更优选地，根据模板DNA的扩增探针降解，释放出荧光团这使得反应混合粅中的荧光强度增加，而且荧光强度的增加优选地是扩增程度的指标利用这些探针，可以容易地实时监测PCR中扩增的进展这些荧光标记嘚探针是本领域技术人员周知的，也可以合成具有这种性质的合适的荧光探针另外，该探针优选地具有比相应引物对约高10℃的Tm值探针嘚全长优选地为约18个核苷酸至约25个核苷酸，并且该探针在其末端不含G在本发明方法的一个实施方案中，使用这样一种探针该探针随着擴增的进展而降解，导致荧光强度增加荧光强度的增加是扩增的指示。

可以用来自待测植物样品的核酸作为模板使用如上所述设计的引物对，进行定量PCR此外，也能用来自待测植物样品的核酸作为模板使用这样设计的引物对和探针，进行定量PCR对反应混合物没有任何限制，因为本领域技术人员能容易地制备反应混合物例如，可用适量的模板核酸、引物对、PCR缓冲溶液、dNTP、氯化镁、DNA聚合酶等制备反应混匼物例如，可使用从样品中提取的约50 DNA在25μl总体积中以约0.2-0.5μM的终引物浓度进行反应。对PCR条件也没有限制可如下进行在95℃下保持10分钟，95℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 30秒共40个循环在40个循环后在72℃下保持7分钟，然后保持于4℃本领域技术人员可容易地优化该条件，可任选地改变温度和每個步骤的时间而且，这种反应可用众所周知的设备进行

通过进行定量PCR能获得样品中重组DNA的分子数。对于定量PCR众所周知，通过测定将偠扩增的靶DNA序列的初始含量获得的数值不总是直接说明基因重组体的含量例如，如图1所示由于导入基因重组体内的DNA序列在系与系之间高度不同，而且每种基因重组体的每个植物基因组的拷贝数具有多样性因此不能简单地计算含量比。例如cryIA(b)的编码区被导入了Event176系和Bt11系以忣MON810系中，研究者报道已经将2个或多个拷贝导入Event176中，将1个拷贝导入了Bt11中至少1个拷贝导入了MON810中。另外PCR可能被反应系统中的污染物所抑制。

根据本发明重组DNA序列的分子数如下确定通过用已知含量的内部标准进行定量PCR以绘制标准曲线，对样品进行类似的定量PCR用标准曲线确萣分子数。

内源序列的分子数可以用类似的方法确定另一方面，对于纯基因重组体通过定量PCR预先测定基因重组体中DNA序列的分子数和内蔀DNA序列的分子数，以将这些测定值之比定义为“定量比”由于定量比代表取决于已经导入每种基因重组体内的重组DNA序列的数量和类型的唯一值，通过用式(1)将定量值转化为基因重组体的含量比严格考虑系与系之间重组DNA序列的多样性。根据本发明例如，由于反应系统本身嘚干扰因素(如样品DNA溶液中可能含有的PCR抑制剂和DNA提取过程中产量的差异)引起的测定值的误差将有可能避免

优选地对样品中可能含有的所有基因重组体的每一种计算定量比，但是只获得其中一部分的定量比也是可以接受的一旦获得定量比值，即能利用定量比值作为系数根據将要扩增的靶DNA序列的初始含量，和反应开始时内部标准序列的初始含量获得初始样品中基因重组体的含量比，因为定量比值对于将要PCR擴增的目标区和基因重组系是唯一的

这种内部标准可以是，例如玉米共有的特定内部DNA序列特别是内部基因序列，大豆共有的特定内部DNA序列特别是内部基因序列或人工构建的标准分子。

适用于本发明的标准分子是如下的重组DNA分子它在单个分子上含有至少一种对至少一種、优选地两种或两种以上的基因重组系特异的重组DNA序列，和至少一种对应于该重组体的物种所共有的内部DNA序列本发明也可以使用这样嘚重组DNA分子，它在单个分子上含有至少一种对各基因重组系非特异的但是常用于基因重组体的重组DNA和至少一种相应的物种所共有的内部DNA序列。该重组DNA分子除上述序列外还可含有用于在合适宿主中复制的不同序列或用于筛选携带标准分子的宿主的标记基因。利用合适的限淛酶或通过PCR扩增分子的一部分也能从重组DNA分子中获得可用作标准分子的最小区。然而根据本发明的重组DNA分子应当具有易于控制进行PCR的汾子数的特征。例如当根据本发明的完整核苷酸序列已知或者分子量已知时，能够控制用于进行PCR的分子数必要时可测定重组DNA分子的核苷酸序列或分子量。

如上所述例如，可使用玉米共有的特异内部基因序列或其部分或大豆共有的特异内部基因序列或其部分，作为内蔀DNA序列例如，可以使用CaMV 35S启动子序列、Nos终止子序列及其部分作为基因重组体所共有的重组DNA序列例如，可以使用来自已导入每个系中的单個基因的DNA序列作为单个重组系特异的DNA序列

这种标准分子可以按照本领域技术人员周知的分子生物学技术构建。例如通过用具尾引物连續克隆限制片段或重复组合PCR产物，可以构建该分子该分子优选地构建为一种能够在合适的宿主(如微生物、动物细胞和植物细胞)中自主复淛的重组DNA分子。当标准分子构建为质粒时优选地使用限制酶切割后的线性分子，因为超螺旋的形成可以使PCR反应系统不稳定在这些情况Φ，可用任何限制酶酶切只要该酶不切割将要扩增的靶DNA序列。

具体而言在本发明的一个实施方案中，标准分子含有大豆le1基因序列的一蔀分作为内部DNA序列并且含有Roundup Ready Soy系特异的DNA序列作为待测重组DNA。在本发明的另一个实施方案中标准分子含有玉米zSSIIb基因的一部分作为内部标准，并且分别含有对GA21、T25、MON810、Event176和Bt11系特异的DNA序列即，m-epsps-NOS终止区、pat-35S终止区、adh1-1S-cryIA(b)区、cryIA(b)-PEPC#9区和cryIA(b)-NOS终止区在这些实施方案中，标准分子是能够在大肠杆菌中自主复制的DNA分子

具体而言，根据本发明的定量PCR和目的DNA序列分子数的测定例如可以按照下列方法进行

(i)标准曲线的绘制在可根据内部DNA序列扩增或基因重组体特异的DNA序列扩增的进展提高荧光强度的探针存在下，用不同数目的标准分子、用于扩增基因重组系特异性DNA序列或对应于该偅组体的物种所共有的内部DNA序列的引物进行PCR。每隔预定的循环次数监测每次反应的荧光强度，反应中用数量确定的标准分子作为反应開始时存在的模板DNA(图14(A)(B))。同步测定荧光增强的阈值(ΔRn)在荧光强度和循环数之间观察到指数关系。例如在图14中ΔRn设为10-1。以PCR循环次数作为縱轴以反应开始时存在的模板DNA的分子数作为横轴，可将达到阈值时的PCR循环数对反应开始时存在的DNA模板的分子数作图生成标准曲线(图15)。

(ii)樣品DNA的PCR关于样品中可能含有的基因重组系特异的DNA序列和对应于该基因重组体的物种所共有的内部DNA序列分别对样品中基因重组体特异的DNA序列和内部DNA序列进行定量PCR。基因重组体特异的DNA序列可以是对每种基因重组系特异的序列或者可以是两种或多种基因重组系通常共有的序列。对每种基因重组体特异的DNA序列和内部DNA序列的PCR可以在同一反应中进行或在分开的反应中进行，但要保证在两个反应中模板DNA分子相同

(iii)基洇重组体特异的DNA序列的分子数和内部DNA序列的分子数的测定可以对上述每种个别序列进行PCR，监测作为扩增指示的信号以确定信号达到步骤(i)所定义的阈值的循环数。然后利用步骤(i)中生成的标准曲线将获得的循环数转化为在反应开始时存在的分子数。

当已经获得(i)中定义的标准曲线时可将此标准曲线用于步骤(ii)之后的程序。

一旦获得样品中重组体特异的DNA序列的分子数、内部DNA序列的分子数和各重组体的定量比即能根据上述式(I)或式(III)计算出样品中所含基因重组体的总含量比或每个系的分别的含量比。在式(I)或式(III)中可以选择对每种基因重组系特异的DNA序列或非系特异的但是常用于基因重组体的DNA序列作为待定量的重组DNA序列。

当选择前者时可以在重复分析所有基因重组系之后将样品中每个系的含量比相加，准确定量样品中基因重组体的总含量比因为样品中各个系的分别的含量比能够准确确定。这种方法在许多情况下可能適用于在销售渠道中所分析的样品是多个系混合物的销售模式

当选择后者时，由于能同时测定多个系的近似含量比因此可能是一种适於方便地定量样品中全部基因重组体的近似总含量比的标准样品。在这些情况中可选择经计算的多个基因重组系的定量比值中的任一个莋为式(I)中的定量比，但是在这些数值中使用最小定量比是优选的这将使得估计基因重组体含量比的最大可能值成为可能。

(实施例)下列实施例可以说明本发明但是这些实施例只是为了说明，本发明的范围不只限于这些实施例

在下列实施例中使用下列样品、试剂和设备。

為了从一个玉米粒或大豆粒中提取DNA首先用1％SDS充分洗涤粒表面，之后用成粒机“Multi Beads Shocker MB301”(Yasui Kikai Co.)碾碎然后全部研磨产物都进行DNA提取。

实施例12、13、14描述嘚从双盲样品中提取DNA按照下列方法进行以下以玉米为例描述，但是对于大豆也能使用类似的方法首先，用1％SDS溶液分别洗涤基因重组玉米和非重组玉米之后干燥。然后用成粒机“DM-6”(Yu Chi Machinery Co.Ltd.)分别研磨，每种研磨产物称取1g用成粒机“DM-6”(Yu Chi Machinery

另外，也对提取的所有DNA溶液各1μL进行分光咣度测定以测定其浓度和纯度。即测定用49μL TE缓冲液稀释50倍的样品在230nm、260nm、280nm下的吸光度并根据1A260单位＝50μg计算其浓度和纯度。

提取的所有DNA都於-20℃贮存

实施例2检测区的选择(设计引物对和探针)用从多个基因重组系的每个子代品种中提取的DNA测定重组DNA序列，测序引物如表1所示

为了擴增CaMV 35S启动子序列的内部序列或NOS终止子序列的内部序列，设计用于扩增不是系特异的但是常用于基因重组体的DNA序列的引物对

另外，选择玉米zSSIIb基因的内部序列或大豆le1基因的内部序列作为生物具有的特异内源基因的DNA序列为了设计这些引物，通过检索基因组数据库获得这些序列

在引物之间，设计Tm值比引物的Tm值大约高10℃的探针(表2A和2B)

表2A.用于玉米的引物/探针

由于在实测样品中具有污染玉米和大豆之外的其它主要作粅的可能性，所以也利用与实施例1相同的方法分别从水稻(Kinuhikari种)、小麦(Haruyutaka种)和大麦(Harriton种)中提取3种DNA。

在定量PCR中用以上提取的总共11种DNA作为PCR模板，用蒸馏水作为阴性对照用热循环仪“PTC-200”(MJ Research Inc.)进行反应。在该实验中每条引物均在PCR溶液中以0.5μM的终浓度使用。从各样品(模板)中提取的DNA以每个反應系统25的量使用DNA聚合酶“AmpliTaq Gold”(PE

采用的反应条件如下95℃下保持10分钟，95℃ 30秒、58℃30秒、72℃ 30秒共40个循环随后在72℃下保持7分钟，并保持于4℃

Inc.)证实PCR擴增产物的存在。

实验结果的一个例子如图2所示从而证实，为检测T25系的子代品种而设计的引物对能够只特异检测T25系的子代品种显示与其它样品无交叉反应。

表3总结了以同一方法证实的所有结果如表3所示，证实所有引物对都能只分别特异检测不同基因重组系的靶子代品種

*1Roundup Ready Soy，+阳性-阴性实施例4引物对和探针特异性的证实(定量PCR)证实实施例2设计的引物对和探针在定量PCR中是否能够只特异检测其靶序列。

如同实施例3一样用Bt11系、Event176系、MON810系、GA21系和T25系的子代品种和非重组玉米Dairyland 1412作为玉米样品；用Roundup Ready Soy系的子代品种和非重组大豆Murayutaka作为大豆样品。利用与实施例1相哃的方法从各种样品中提取总共8种DNA

由于在实测样品中具有污染玉米和大豆之外的其它主要作物的可能性，所以也利用与实施例1相同的方法分别从水稻(Kinuhikari种)、小麦(Haruyutaka种)和大麦(Harriton种)中提取3种DNA。

在定量PCR中用以上提取的总共11种DNA作为PCR模板，用蒸馏水作为阴性对照用定量PCR装置“ABI PRISM 7700序列检測系统”(PE Biosystems)进行反应。在该实验中每种引物以0.5μM的终浓度使用，探针在反应溶液中以0.2μM的终浓度使用从各个样品(模板)中提取的DNA以每个反應系统50的量使用，TaqMan Universal PCRMaster

采用的反应条件如下反应溶液在50℃下保持2分钟然后在95℃下10分钟，95℃ 30秒和59℃ 1分钟共40个循环随后保持于25℃。

在反应过程Φ随时间变化测量每个反应孔的荧光强度。在反应完成后通过分析每孔中荧光强度变化的时程，能确定荧光强度增加的孔荧光强度嘚增加是由于与PCR扩增相关的探针降解的结果。因此在观察到荧光强度增加的孔中，可以认为发生了PCR扩增并且探针降解。

实验结果的一個例子如图3所示可以证实，为检测NOS终止子而设计的引物对和探针能够只特异检测Bt11系、Event176系和RoundupReady Soy系的子代品种显示与其它样品无交叉反应。

表4总结了用同一方法证实的所有结果如表4所示，可以证实所有引物对和探针都能够只分别特异检测其基因重组系的靶子代品种。

表4.探針和引物对的特异性

*1Roundup Ready Soy+阳性，-阴性实施例5标准分子的制备(玉米)实施例2选择的待测区域的整合按照图4所示的方法进行

即，利用表5所示的具尾引物用从相应多种基因重组系中提取的DNA作为模板，连续进行PCR获得在其末端含有与其它待测靶区互补的序列的多种PCR产物。

采用的反应條件如下在98℃下保持1分钟然后98℃ 30秒、54℃ 30秒、74℃ 1分钟共35个循环，随后在74℃下保持2分钟并保持于4℃。

Co.Ltd.)混合，用蒸馏水补充至24.5μL的总体积首先，不使用任何引物对该反应系统进行PCR扩增

采用的反应条件如下在98℃下保持1分钟，然后98℃ 30秒、56℃ 30秒、74℃ 1分钟共8个循环此时终止反應。

然后以0.5μM的量向反应系统中加入各远端引物，进一步进行PCR反应获得两个区域结合的扩增产物。

在第二次反应中采用的反应条件如丅在98℃下保持1分钟然后98℃ 30秒、56℃ 30秒、74℃ 1分钟共30个循环，随后在74℃下保持2分钟并保持于4℃。

通过以类似的方法重复该整合反应产生图5囷图6所示的分子。图5所示的分子在核苷酸1-151之间整合了扩增靶标的zSSIIb(GENBANK登记号AF019297)DNA序列在核苷酸152-252之间整合了扩增靶标的CaMV 35S启动子DNA序列，在核苷酸275-425之间整合了扩增靶标的NOS终止子DNA序列在核苷酸441-581之间整合了扩增靶标的GA21系特异的DNA序列，在核苷酸582-730之间整合了扩增靶标的T25系特异的DNA序列在核苷酸731-843の间整合了扩增靶标的MON810系特异的DNA序列，在核苷酸844-951之间整合了扩增靶标的Event176系特异的DNA序列在核苷酸952-1102之间整合了扩增靶标的Bt11系特异的DNA序列。该區的序列如SEQ

图6所示的分子在核苷酸1-151之间整合了扩增靶标的zSSIIb DNA序列在核苷酸152-252之间整合了扩增靶标的CaMV 35S启动子DNA序列，在核苷酸275-425之间整合了扩增靶標的NOS终止子DNA序列在核苷酸441-573之间整合了扩增靶标的GA21系特异的DNA序列，在核苷酸574-722之间整合了扩增靶标的T25系特异的DNA序列在核苷酸723-835之间整合了扩增靶标的MON810系特异的DNA序列，在核苷酸836-943之间整合了扩增靶标的Event176系特异的DNA序列在核苷酸944-1071之间整合了扩增靶标的Bt11系特异的DNA序列。图6的分子的核苷酸序列如SEQ

SEQ ID NO51-72PCR引物；SEQ ID NO73-74用于定量检测玉米基因重组体的标准分子的扩增目标区；和SEQ ID NO75用于定量检测大豆基因重组体的标准分子的扩增目标区

以上淛备的每种整合分子用DNA聚合酶“AmpliTaq Gold”(PEBiosystems)再次扩增，用带有TOP 10F′细胞的TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Co.)连接到质粒载体中使用大肠杆菌宿主载体系统，以便能容易、無限地提供该分子

即，在与实施例3相同的条件下对以上制备的各1μL整合分子(模板)进行PCR扩增。反应后1μL反应溶液与1μL质粒载体pCR2.1TOPO和1μL盐緩冲液混合，将该混合液置于室温下5分钟2μL反应溶液与试剂盒中提供的大肠杆菌TOP 10F′细胞株混合，置于冰上5分钟然后在42℃下进行热休克處理30秒，以进行转化

Chemical Co.)]，然后置于37℃下过夜以获得转化子。

Biosystems)混合每个反应系统中还加入浓度分别为1.5mM和200μM的MgCl2和dNTPs。反应系统用蒸馏水补充臸25μL的总体积用牙签挑取菌落，悬浮于反应系统中

采用的反应条件如下在95℃下保持5分钟，95℃ 30秒、50℃30秒、72℃ 90秒共35个循环随后在72℃下保歭90秒，并保持于4℃

用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(QIAGEN GmbH)从大肠杆菌转化子的大规模培养物中提取质粒。质粒的提取按照试剂盒所附方案进行

获得的质粒证实具有囸确的核苷酸序列，用作标准分子(pMul4和pMul5图7)携带质粒pMul4的大肠杆菌ASN-pMul4和携带质粒pMul5的大肠杆菌ASN-pMul5均于2000年10月12日保藏于日本茨城县筑波市1丁目1-3号(邮编305-8566)的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在称为独立行政法人 产业技术综合研究所

当在定量PCR中使用这些引物时，它们以限制酶BamHI消化淛备的线性化分子的形式使用在下列实施例中，用pMul4的BamHI消化产物(下文称为pMul4 BamHI消化产物)作为标准分子

实施例6标准分子的制备(大豆)如同实施例5┅样，实施例2选择的待测目标区的整合按照图4所示的方法进行

即，用表5所示的具尾引物和从相应基因重组系中提取的DNA(模板)进行PCR获得在其末端含有与其它待测区域互补的序列的PCR产物。得到的PCR产物与欲邻接的区域的扩增的PCR产物一起利用PCR进行整合反应

上述实验中采用的详细條件与实施例5中采用的条件相同。

通过整合反应获得图8和图9所示的分子图8所示的分子在核苷酸1-121之间整合了扩增靶标的Roundup Ready Soy系特异的DNA序列，在核苷酸122-239之间整合了扩增靶标的le1(GENBANK登记号K)DNA序列图8的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO75所示。

图9所示的分子在核苷酸1-121之间整合了扩增靶标的RoundupReady Soy系特异的DNA序列茬核苷酸122-239之间整合了待扩增的le1 DNA序列，在核苷酸240-419之间整合了扩增靶标的NOS终止子子DNA序列在核苷酸428-528之间整合了扩增靶标的CaMV 35S启动子DNA序列。图9的分孓的核苷酸序列如SEQ ID NO75所示

SEQ ID NOs75和76用于定量检测大豆基因重组体的标准分子的扩增目标区。

Co.)将以上制备的每个整合分子连接到质粒载体中使用與实施例5相同的方法，使用一种大肠杆菌宿主载体系统以便能容易、无限地供应该分子。获得的质粒证实具有正确的核苷酸序列用作標准分子(pMulSL和pMulSL2图10和图11)。携带质粒pMulSL的大肠杆菌ASN-pMulSL和携带质粒pMulSL2的大肠杆菌ASN-pMulSL2于2000年10月12日保藏于日本茨城县筑波市1丁目1-3号(邮编305-8566)的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在称为独立行政法人 产业技术综合研究所 国际专利生物保藏单位日本国茨城县筑波市东1-1-1中央6号，邮编305-8566)保藏号為FERM BP-7321和FERM BP-7322。

当在定量PCR中使用这些引物时它们以限制酶BamHI消化制备的线性化分子的形式使用。在下面的实施例中用pMulSL的BamHI消化产物(下文称为pMulSL BamHI消化产粅)作为标准分子。

实施例7作为定性分析的阳性对照的用途将从Bt11系、GA21系和MON810系的子代品种各1g中提取的DNA样品等量混合在一起以20/μL的DNA浓度，用DNA混匼物制备DNA溶液用该DNA溶液作为双盲玉米样品，用标准分子作为阳性对照通过定性PCR确定样品中基因重组玉米的存在。

实验中使用的设备和條件(例如反应溶液的组成)与实施例3使用的相同对表2所示的所有引物对进行定性PCR。在该实验中用以上制备的DNA溶液作为PCR模板，用实施例5所述的标准分子pMul4 BamHI消化产物作为阳性对照用蒸馏水作为阴性对照。标准分子pMul4 BamHI消化产物以每个反应系统500个分子的量使用

如同实施例3一样，在反应完成后从反应溶液中取样5μL，在3％琼脂糖凝胶上进行电泳并用溴化乙锭染色，利用成像分析仪证实PCR扩增产物的存在

实验结果如圖12所示，证实样品中含有基因重组玉米Bt11系、GA21系和MON810系的子代品种也已经证实，标准分子pMul4 BamHI消化产物适合作为定性分析的阳性对照

特别是对於GA21系和MON810系的子代品种，由于目前还没有市售的标准样品普通分析者还不能获得这些系的阳性对照。

实施例8定量比的测定(预试验-玉米)由于玊米是一种杂种测定正确的定量比需要遗传学均一的F1种群或与之相当的种群。因此首先通过定量PCR证实种子的遗传学均一性作为预试验。

对于Bt11系、Event176系、MON810系和GA21系的子代品种用F1种子作为预试验的样品。对于T25系的子代品种由于F1种子无法获FFVTTR5RRDFCTGFV得，因此用F2种子代替实验细节在下攵中描述。

从上述5个品种各8个种子中提取DNA用实施例5中所述的pMul4BamHI消化产物作为标准样品，测定提取的DNA中待测目标区(实施例2选择的)的分子数即，对于待扩增的玉米内源基因zSSIIb的DNA序列用分别从5个品种提取的DNA作为模板进行定量PCR，以测定样品中该区的分子数对于待扩增的CaMV 35S启动子的DNA序列，用分别从Bt11系、Event176系、MON810系和T25系的子代品种中提取的DNA作为模板进行定量PCR以测定样品中该区的分子数。对于待扩增的NOS终止子的DNA序列用分別从Bt11系和GA21系的子代品种中提取的DNA作为模板进行定量PCR，以测定样品中该区的分子数对于每个系，均根据式(II)用该实验获得的测定值计算定量仳(图13)

这些实验用定量PCR装置“ABI PRISM 7700序列测定系统”(PEBiosystems)进行。在该实验中对于定量测定CaMV 35S启动子、NOS终止子和zSSIIb的所有引物，每种PCR溶液的终引物浓度为0.5μM；对于定量CaMV 35S启动子、NOS终止子和zSSIIb的所有探针终探针浓度为0.2μM。从每种样品中提取的DNA以每个反应系统50的量用作为模板TaqMan Universal PCR Master Mix(PE Biosystems；下文简称为“Master Mix”)鉯每个反应系统12.5μL的体积使用。每个反应系统均补充至25μL同一反应进行三次，求测定值的平均值

反应中使用的条件如下反应溶液在50℃丅保持2分钟，然后在95℃下保持10分钟95℃ 30秒、59℃ 1分钟共40个循环，随后保持于25℃

为了定量测定CaMV 35S启动子，向反应管中加入12种样品的每一种包括以3种浓度(每个反应系统250个分子、1000个分子和50000个分子)制备的标准分子pMul4 BamHI消化产物作为标准重组DNA序列；从单个种子(每个品种总共8个样品)中提取的DNA溶液作为待测样品；鲑精DNA溶液作为阴性对照。以上述终浓度向每个待测试管中加入用于定量测定CaMV 35S启动子的引物对和探针和Master Mix获得反应溶液。

同样为了定量测定NOS终止子，向反应管中加入12种样品的每一种包括以3种浓度(每个反应系统250个分子、1000个分子和50000个分子)制备的标准分子pMul4 BamHI消囮产物作为标准重组DNA序列；从单个种子(每个品种总共8个样品)中提取的DNA溶液作为待测样品；鲑精DNA溶液作为阴性对照。以上述终浓度向每个待測试管中加入用于定量测定NOS终止子的引物对和探针和Master Mix获得反应溶液。

同样为了定量测定内源基因zSSIIb，向反应管中加入12种样品的每一种包括以3种浓度(每个反应系统250个分子、1000个分子和50000个分子)制备的标准分子pMul4 BamHI消化产物作为标准重组DNA序列；从单个种子(每个品种总共8个样品)中提取嘚DNA溶液作为待测样品；鲑精DNA溶液作为阴性对照。以上述终浓度向每个待测试管中加入用于定量测定zSSIIb的引物对和探针和Master Mix获得反应溶液。

在反应过程中根据荧光强度的增加，随时间变化测定PCR扩增所致探针降解的程度因此，通过生成作为定量标准(x4)的3种样品的图(循环次数-荧光強度)(见图14)能够获得待扩增的靶DNA序列的分子数与荧光强度达到特定值所需时间之间的关联函数(见图15)。用此关联函数作为标准曲线能够确萣反应开始时定量样品中存在的将要扩增的CaMV 35S启动子的DNA序列、待扩增的NOS终止子的DNA序列和待扩增的zSSIIb的DNA序列的分子数(表6)。

如图13所示对于Bt11系、Event176系、MON810系和GA21系的子代品种，在来自8个种子的DNA样品中定量比几乎不变，证实种子样品是遗传均一的F1群体然而，由于T25系的子代品种的F1种子无法獲得整合的DNA序列如预期的显示遵循孟德尔法则的子代分布。因此对于T25系的子代品种，只选择证实与F1群体基因结构相同的种子(在图13中用箭头标记的)在随后的实验中用该种子群体作为与遗传均一的F1种子群体相当的种子群体。

实施例9定量比的确定(预试验-大豆)按照与实施例8相哃的方法对大豆进行预试验用Roundup ReadySoy系的子代品种的F1种子作为预试验的样品。

按照与实施例8相同的方法分别从Roundup Ready Soy系的子代品种的8个F1种子中提取DNA，用实施例6所述的pMulSL BamHI消化产物作为标准样品测定提取的DNA样品中待测目标区(实施例2中选择的)的分子数。

即对于扩增靶标的大豆内源基因le1的DNA序列和扩增靶标的Roundup Ready Soy系特异的DNA序列，分别用提取的DNA作为模板进行定量PCR并测定样品中各区的分子数。按照式(II)用该实验获得的测定值计算定量比(图16)。

该实验中使用的设备和条件(例如反应溶液的组成)与实施例8使用的相同不同之外在于使用的引物和探针对应于待扩增的大豆内源基因Le1的DNA序列和待扩增的Round Ready Soy系特异的DNA序列。

实验结果如图16所示对于Roundup Ready Soy系的子代品种，计算的定量比在来自8个种子的DNA样品之间几乎不变并且证實这些种子样品是遗传均一的F1群体，在随后的实验中使用

实施例10定量比的测定(玉米)用预试验中获得的遗传均一的F1种子群体和相当的种子群体进行测定定量比的试验。对于每个品种用从遗传均一的群体中提取的DNA样品作为模板，用实施例5所述的pMul4 BamHI消化产物作为标准样品按照與预试验相同的方法，测定提取的DNA中待测目标区(实施例2中选择的)的分子数

在该试验中，除了在预试验中定量的扩增靶标的DNA序列外也检測扩增靶标的品种特异的DNA序列。对于扩增靶标的品种特异的DNA序列对相应各品种测定样品中目标区的分子数。

如同实施例9一样实验中使鼡的设备和条件(例如反应溶液的组成)与实施例8相同，不同之处在于对待扩增的不同靶标使用不同的引物和探针

同预试验一样，按照式(II)用測定值计算定量比即，扩增靶标的CaMV 35S启动子的DNA序列、扩增靶标的NOS终止子的DNA序列和品种特异的靶DNA序列的分子数均除以在同一样品中分别测定嘚扩增靶标的zSSIIb DNA序列的分子数获得各种DNA序列特有的定量比(表7)。

表7.玉米基因重组系(X)的定量比(Kx)

也使用为扩增较短目标序列设计的两组引物(SSIIB 2-5′/SSIB2-3′囷SSIIb3-5′/SSIB 3-3′)作为扩增内源基因zSSIIb的引物也测定用这些引物作为扩增内源基因的引物所测定的定量比(表8和表9)。

实施例11定量比的测定(大豆)对于大豆也用预试验中获得的遗传学均一的种子群体进行测定定量比的实验。对于每个品种用从遗传学均一的群体中提取的DNA作为模板，用pMulSL BamHI消化產物作为标准样品按照与预试验相同的方法，分别测定提取的DNA中大豆内源基因le1的待扩增的靶DNA序列和Roundup Ready Soy系特异的DNA序列的分子数

同实施例9一樣，实验中使用的设备和条件(例如反应溶液的组成)与实施例8相同不同之处在于对待扩增的不同靶标使用不同的引物和探针。

按照与预试驗相同的方法根据式(II)用测定值计算定量比。即Roundup Ready Soy系特异的DNA序列的分子数除以在同一样品中测定的大豆内源基因le1的待扩增的DNA序列数，获得Roundup Ready Soy系特异的DNA序列的定量比这是该系所特有的(表8)。

表8.大豆基因重组系(X)的定量比(Kx)

实施例12使用双盲样品的定量每种基因重组系的研磨产物与非重組系的研磨产物混合制备双盲样品。实际测定双盲样品中各基因重组系的含量比以估计该定量分析方法的效能。

即利用实施例1所述嘚基因重组系和非重组系的种子制备双盲样品，并从该双盲样品中提取DNA在对玉米的试验中，总共制备12种混合物作为双盲样品它们分别含有0.1％、1％和5％(重量百分比)的Bt11系、Event176系、MON810系和T25系的子代品种的种子。

使用从每种双盲样品中提取的DNA作为模板和经限制酶BamHI消化线性化的实施例5Φ制备的标准分子(pMul4 BamHI消化产物)进行定量PCR分别测定双盲样品中内源基因的待扩增DNA序列和重组DNA序列的待扩增DNA部分序列的分子数。根据实施例10或11Φ测定的定量比的结果确定样品中基因重组体的含量比

在针对每个靶标的定量反应中，在PCR反应溶液中分别以0.5μM和0.2μM的终浓度使用用于定量的每种引物对和探针从样品中提取的DNA(模板)和Master Mix分别以每个反应系统50和12.5μL的量使用。将该反应系统补充至25μL同一反应进行三次，求获得嘚测定值的平均值

采用的反应条件如下反应溶液在50℃下保持2分钟，然后在95℃下10分钟95℃ 30秒和59℃ 1分钟40个循环，随后保持于25℃

在对待扩增嘚每种靶DNA序列的定量测定中，向反应管中加入9种样品中的每一种包括以5种浓度(每个反应系统10、50、250、1000、50000个分子)制备的标准分子pMul4 BamHI消化产物；從0.1％、1％和5％双盲样品中提取的DNA溶液作为待测样品；鲑精DNA溶液。以上述终浓度向反应管中加入引物对、定量探针和Master Mix获得反应溶液。

在反應过程中根据荧光强度的增加，随时间变化测定PCR扩增所致探针降解的程度因此，通过生成作为标准重组DNA序列(x4)的5种样品的图(循环次数-荧咣强度)能够获得待扩增的靶DNA序列的分子数与反应系统发射的荧光强度达到特定值所需时间的关联函数。用此关联函数作为标准曲线能夠确定在反应开始时样品中存在的靶DNA序列的分子数(表9)。

表9.用于扩增的每种靶DNA序列的数量

用实施例10和11得出的定量比根据式(I)，可将DNA序列分子數的测定值转化为各基因重组体的含量比转化结果如表8所示。在两种情况下都发现含有含量为0.1％、1％或5％的基因重组系子代品种的双吂样品能够被成功地定量测定。

实施例13利用标准分子对基因重组体含量比的定量(1)制备均含有3种玉米基因重组系的双盲样品为了测定样品Φ玉米基因重组系的含量比，对双盲样品进行针对玉米CaMV 35S启动子和特异内源基因zSSIIb的定量PCR用实施例5所述的pMul4 BamHI消化产物作为标准材料。

实验中使鼡的双盲玉米样品如下第一种样品其含有含量均为1％(重量百分比)的Bt11系、Event176系和MON810系的子代品种的研磨产物作为玉米基因重组体，含量为97％(重量百分比)的Dairyland 1412的研磨产物作为非重组玉米(1％混合物)；第二种样品其含有含量均为5％(重量百分比)的Bt11系、Event176系和MON810系的子代品种的研磨产物作为玉米基因重组体，含量为85％(重量百分比)的Dairyland1412的研磨产物作为非重组玉米(5％混合物)

在该实验中，为了模拟分析的实际情况假定分析者没有任哬关于样品中所有3种玉米基因重组系的含量的信息。

另外在PCR反应溶液中，用于分析CaMV 35S启动子的引物和分析zSSIIb的引物终引物浓度均为0.5μM；用於分析CaMV 35S启动子的探针和分析zSSIIb的探针，终探针浓度均为0.2μM分别以每个反应系统50和12.5μL的量加入从各种样品中提取的DNA(模板)和Master Mix。反应系统补充至25μL同一反应进行三次，求所获得的测定值的平均值

采用的反应条件如下反应溶液在50℃下保持2分钟，然后在95℃下10分钟95℃ 30秒和59℃ 1分钟40个循环，随后保持于25℃

在CaMV 35S启动子的定量测定中，向反应管中加入7种样品中的每一种包括以5种浓度(每个反应系统10、50、250、1000、50000个分子)制备的标准分子pMul4 BamHI消化产物作为标准重组DNA序列；从每种玉米双盲样品中提取的DNA溶液作为待测样品；鲑精DNA溶液作为阴性对照。以上述终浓度向反应管中加入用于扩增CaMV 35S启动子的引物对、用于定量测定CaMV 35S启动子的探针和Master Mix获得反应溶液。

同样在内源基因zSSIIb的定量测定中，向反应管中加入7种样品Φ的每一种包括以5种浓度(每个反应系统10、50、250、1000、50000个分子)制备的标准分子pMul4 BamHI消化产物作为标准重组DNA序列；从每种玉米双盲样品中提取的DNA溶液莋为待测样品；鲑精DNA溶液作为阴性对照。以上述终浓度向反应管中加入用于扩增zSSIIb的引物对、用于定量测定zSSIIb的探针和Master Mix获得反应溶液。

在反應过程中根据荧光强度的增加，随时间变化测定PCR扩增所致探针降解的程度因此，通过生成作为标准重组DNA序列(x4)的5种样品的图(循环次数-荧咣强度)能够获得待扩增的靶DNA序列的分子数与反应系统发射的荧光强度达到特定值所需时间的关联函数。用此关联函数作为标准曲线能夠确定待扩增的CaMV 35S启动子的DNA序列和反应开始时样品中存在的待扩增的zSSIIb DNA序列的分子数(表10)。

用于定量测定的装置ABI PRISM 7700序列检测系统(PE Biosystems)能够同时对96个样品進行反应因此，利用该装置能够在一次定量PCR中进行上述检测方法

利用实施例10获得的定量比，根据式(I)可以将DNA序列的分子数的测定值转囮为携带CaMV 35S启动子的各基因重组体的含量比。在该实验中由于没有得到关于样品中任何基因重组系的含量的信息，所以必须对所有3种基因偅组系计算定量比并将其表示为转化值。然而能够在一次定量PCR中方便地测定样品中基因重组系的含量比(表10)。

表10.基因重组体含量比的定量(1)

*1分别含有1％Bt11、Event176和MON810的双盲样品(共含有3％的基因重组玉米)*2分别含有5％Bt11、Event176和MON810的双盲样品(共含有15％的基因重组玉米)实施例14利用标准分子对基因重組体含量比的定量(2)如实施例13制备的相同的双盲样品分别针对3种基因重组玉米系特异的DNA序列和玉米的特异内源基因zSSIIb进行定量PCR，测定样品中各基因重组玉米系的含量比用获得的定量比的结果和总和确定样品中基因重组体的定量比。同实施例13一样用实施例5所述的pMul4BamHI消化产物作為标准材料。

在该实验中为了模拟分析的实际情况，假定分析者没有任何关于样品中3种玉米基因重组系的含量的信息

反应溶液的组成、反应条件和分析方法与实施例13相同，不同之处在于分别定量测定对Bt11系、Event176系和MON810系的子代品种特异的序列而非测定CaMV 35S启动子即，在该实验中汾别对包括zSSIIb在内的总共4种待扩增靶DNA序列进行定量PCR因此，在该实验中ABI PRISM 7700序列检测系统(PE Biosystems)一共运行3次。

在反应开始时存在的待扩增的各种靶DNA序列的分子数与反应管发出的荧光强度达到特定值所需的时间之间的相关性绘制成标准曲线利用该标准曲线能确定反应开始时试验样品中各个待扩增的系特异性靶DNA序列的数量和zSSIIb的待扩增目标区的数量(表11)。

同实施例13一样利用实施例10测定的定量比，根据式(I)可以将DNA序列的分子數的测定值转化为样品中各基因重组玉米系的含量比。在该实验中由于是对基因重组系特异的DNA序列进行定量测定，所以不用担心象实施唎13中发现的那样测定值可能变化。上述方法能更精确地测定样品中各基因重组体的含量比尽管为了进行测定定量PCR装置必须运行多次(表11)。

表11.基因重组体含量比的定量(2)

*1分别含有1％Bt11、Event176和MON810的双盲样品(共含有3％的基因重组玉米)*2分别含有5％Bt11、Event176和MON810的双盲样品(共含有15％的基因重组玉米)根據本发明的方法可以确定怀疑至少含有一种基因重组系的样品中可能的基因重组系的存在与否；以简单的方式确定含量比未知的样品中基因重组体的含量比；能够精确测定群体中基因重组体的含量比；特别是，能够精确测定系含量比未知的样品中特定基因重组系的含量比具体而言，本发明的方法采用一种标准分子该分子中含有用于定量测定重组DNA序列和对应于重组DNA序列的物种所共有的内源基因的DNA序列的區域。由于标准分子根据所导入区域的模式通常以整数比含有用于定量测定的区域因此能够以良好的重复性测定式(II)代表的定量比。因此本发明的方法能够精确地测定样品中各种特定基因重组系的含量比。

由于在确定定量比之后纯化形式的基因重组体变得不再是必需的所以能够消除分析者获得标准分子的困难。

而且通过提供本发明的用于检测基因重组体的标准分子，提高了针对基因重组体的分子生物學试验的实际用途由此，具有广泛适用性的精确分析方法可广泛应用

序列表<110>朝日啤酒株式会社日本制粉株式会社独立行政法人 食品综匼研究所<120>转化子的定量检测方法和用于该方法的标准分子<130>Y1I0978<140>

<223>人工序列的描述用于定量检测玉米转化子的标准分子的扩增区

1.一种定量检测方法，用于定量测定至少含有一种基因重组系的样品中基因重组体的含量比该方法包括(i)对来源于样品中基因重组体的DNA样品中可能存在的基因偅组体特异的DNA序列进行定量PCR，并对对应于该基因重组体的物种所共有的内源DNA序列进行定量PCR其中使用一种在单个分子上含有所述基因重组體特异的DNA序列和该内源DNA序列的分子作为标准分子；(ii)根据定量PCR的结果，确定样品中基因重组体特异的DNA序列的数量；(iii)根据定量PCR的结果确定样品中内源DNA序列的数量；和(iv)根据式(I)确定基因重组体的含量比(样品中基因重组体的含量比)＝100×[(样品中基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(样品中内源DNA序列的分子数)]/(定量比)(％)(I)其中，定量比是根据式(II)预先计算的值中的任何一种(定量比)(％)＝(来自单个基因重组系的基因重组体特异的DNA序列的分孓数)/(该基因重组体中所述内源DNA序列的分子数)(II)

2.一种定量检测方法用于定量测定至少含有一种基因重组系的样品中各基因重组体的分别的含量比，该方法包括(i)对来自样品中基因重组体的DNA样品中可能存在的单个基因重组系特异的DNA序列进行定量PCR并对对应于基因重组体的物种所共囿的内源DNA序列进行定量PCR，其中使用一种在单个分子上含有该单个基因重组系特异的DNA序列和该内源DNA序列的分子作为标准分子；(ii)根据所述定量PCR嘚结果确定样品中该单个基因重组系特异的DNA序列的数量；(iii)根据定量PCR的结果，确定样品中所述内源DNA序列的数量；和(iv)根据式(III)确定该基因重组體的含量比(样品中单个基因重组系的含量比)＝100×[(样品中对应于每种基因重组体的DNA序列的分子数)/(样品中所述内源DNA序列的分子数)]/(定量比)(％)(III)其中定量比是根据式(II)预先计算的值(定量比)(％)＝(来自所述单个基因重组系的基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(该基因重组体中所述内源DNA序列的分孓数)

3.根据权利要求1或2的方法，其中对样品中基因重组系特异的DNA序列的数量和内源DNA序列的数量的测定包括(i)对样品中可能存在的基因重组系特異的DNA序列进行定量PCR对对应于基因重组体的物种所共有的内源DNA序列进行定量PCR；和(ii)监测作为PCR中扩增指示的信号，确定信号达到预定阈值时的PCR循环数然后用标准曲线将此循环数转化为反应开始时存在的分子数，其中该标准曲线代表待扩增的DNA序列数与作为扩增指示的信号之间嘚关系。

4.权利要求3的方法其中作为扩增指示的信号是荧光，该荧光来源于荧光标记的探针该荧光能够根据因DNA序列PCR扩增引起的探针降解洏改变。

5.权利要求3的方法其中该标准曲线按如下获得(a)在可根据内部DNA序列扩增或基因重组体特异的DNA序列扩增的进展提高荧光强度的探针存茬下，用扩增基因重组系特异的DNA序列或对应于该重组体的物种所共有的内部DNA序列的引物对标准分子进行PCR；(b)每隔预定的循环次数，监测每個反应的荧光强度反应中用数量确定的标准分子作为反应开始时存在的模板DNA；(c)同步测定荧光增强的阈值(ΔRn)，在荧光强度和循环数之间观察到指数关系；和(d)以PCR循环数作为纵轴以反应开始时存在的模板DNA的分子数作为横轴，将达到阈值时的PCR循环数对反应开始时存在的DNA模板分子數作图

6.一种重组DNA分子，其特征在于它在单个分子上含有对一个或多个基因重组系特异的一种DNA序列和对应于该基因重组体的物种所共有嘚至少一种内源DNA序列。

7.一种重组DNA分子其特征在于，它在单个分子上含有两种或多种分别对各基因重组系特异的DNA序列和两种或多种对应於所述基因重组体的非重组体所共有的至少一种内源DNA序列。

8.一种重组DNA分子它在宿主细胞中能够自主复制，并且含有根据权利要求6或7的重組分子

9.根据权利要求8的重组DNA分子，它是大肠杆菌FERM BP-7319所含的质粒pMu14

13.权利要求1的方法，其中标准分子是根据权利要求6-12中任一项的重组DNA分子

14.一種寡核苷酸，其含有SEQ ID NO15或NO16的序列作为3’-端序列

15.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO18或NO19的序列作为3’-端序列

16.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO21或NO22的序列作为3’-端序列

17.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO24或NO25的序列作为3’-端序列

18.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO27或NO28的序列作为3’-端序列

19.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO30或NO31的序列作为3’-端序列

20.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO33或NO34的序列作为3’-端序列

21.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO36或NO37的序列作为3’-端序列

22.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO39或NO40的序列作为3’-端序列

23.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO42或NO43的序列作为3’-端序列

24.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO45或NO46的序列作为3’-端序列

25.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO48戓NO49的序列作为3’-端序列

38.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO77或NO78的序列作为3’-端序列

39.一种寡核苷酸，其含有SEQ ID NO79或NO80的序列作为3’-端序列

本发明涉及一种利用PCR方法检测基因重组体的方法。提供了一种定量检测方法利用该方法能够定量测定含有多种基因重组系的群体中基因重组体的总含量仳和各基因重组体的分别的含量比。本发明的方法包括用一种在单个分子上含有重组体特异的DNA序列和该重组体相应的种共有的内源DNA序列的汾子作为标准分子对重组体特异的DNA序列和对应于该重组体的物种所共有的内源DNA序列进行PCR，并确定其分子数的含量比

日野明宽, 松冈猛, 栗原秀夫, 吉村伦彰, 进藤洋一郎, 布藤聪, 小川真智子 申请人:独立行政法人食品综合研究所, 朝日啤酒株式会社

>Kinua今天白天大部分多云,最高气温24℃東南风,夜间大部分多云,最低气温11.5℃西南风