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黄曲霉菌主要真菌毒素次级代谢与调控的研究进展
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微生物学通报 Jul. 20, ): 1425?logy China ? stitute logy, . DOI: 10.13344/l.china.130598 基金项目:国家自然科学基金项目(No. );国家 973 计划项目(No. );国家现代农业产业技术 体系建设专项项目(No. CARS-14);科技基础性工作专项项目(No. ) *通讯作者:Tel:86-27-; : 收稿日期:;接受日期:;优先数字出版日期(): 专论与综述 黄曲霉菌主要真菌毒素次级代谢与调控的研究进展 王后苗 廖伯寿* 雷永 黄家权 晏立英 (中国农业科学院油料作物研究所 农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室 湖北 武汉 430062) 摘要:黄曲霉菌( )是一种腐生型好氧真菌,其次级代谢产生的黄曲霉毒素 (,AFT)是一种强致癌性剧毒物质.黄曲霉菌侵染农作物导致相关农产品黄曲霉毒素的 污染,危及食品安全及人和动物的健康.黄曲霉菌有 8 条染色体,基因组大小约 37 Mb,含有 13 000 多个功能基因, 55 个次级代谢基因簇, 其中只明确了 AFT、 环匹阿尼酸(id, CPA)和黄曲霉震颤素(rem) 3 个次级代谢基因簇的特征.次级代谢基因簇的表达受不同环境 条件、次级代谢调控因子、酶活性、复杂的脂氧合物转导信号及群体密度效应的调控.LaeA 和VeA 是抑制 AFT、CPA 和黄曲霉震颤素等真菌毒素生物合成的次级代谢调控因子,抑制加氧酶 类(Ppo 和Lox)的表达则能促进真菌毒素的合成,而其氧化产物(脂氧合物)则是真菌-寄主互作的 重要信号分子.群体密度和水解酶类也影响黄曲霉菌的次级代谢,群体密度高能降低黄曲霉毒素 的生成量而增加分生孢子的形成;α-淀粉酶、果胶酶、蛋白酶等酶活性的改变可以影响黄曲霉菌 分生孢子萌发、菌丝生长,以及真菌毒素的次级代谢.本文系统评述了黄曲霉主要真菌毒素的次 级代谢与调控的研究进展.此外,对黄曲霉次级代谢物的研究也做了进一步的评述和讨论. 关键词:黄曲霉菌,真菌毒素,次级代谢,调控
on te n of
WANG ou* LEI Yong HUANG Jia--Ying (ory of Oil Crop Biology of the riculture, Oil stitute , Wuhan, Hubei 430062, China) t:
, ytic aerobic fun- gus, veral crops such t, red as
g g animal and human .
d and the genome size is about 37 Mb on
g over 13 . In the
(NRRL3357), te en identified based on backbone enzyme gene analysis by SMURF, and g AFT, id (CPA) terized. The te clusters ed by 1426 微生物学通报 l. China 2014, Vol.41, No.7 ./ different environmental factors, ors, tivity,
nsing. AFT, CPA hibited by the ors, LaeA and VeA, sm. A family - and their d by ppo and lox
duce d AFT. s of A.
g α-, , , ,
important n and virulence to host tissue. Further research sm
are also dis- d. Keywords:
, s, te, n 黄曲霉菌 ( )是子囊菌亚 门(a)、曲霉属()一种常见的腐 生型好氧真菌(/ ml),主要分布在 16°C35°的温带地区,而 在高于 45°纬度的地区则极少见[1] .黄曲霉菌在土 壤中以分生孢子或菌核的形式存在,在植物组织中则 以菌丝体的形式存在.菌核能在极端环境条件下(高温、干旱等)存活,并能产生分生孢子或子囊孢子[2-3] . 黄曲霉菌是人和动、植物的共同病原菌.人和 动物长期接触黄曲霉菌和其他 20 多种曲霉菌可诱发 哮喘、外源性肺泡炎和过敏性支气管曲霉病等疾 病[4-6] .在作物田间生长期间,即作物收获前,黄曲 霉菌能诱发多种农作物病害的发生,如玉米穗腐病、 花生曲霉病、棉花棉铃曲霉病等病害的发生[1,7] . 黄曲霉毒素(s,AFT)[1] 、环匹阿尼酸 (id , CPA) 、 黄曲霉震颤素(rem)[8] 等次级代谢物是全球范围内危及食品 安全和人类健康的主要因素之一. 黄曲霉菌侵染农 作物后可导致农产品黄曲霉毒素污染的发生. 黄曲 霉菌侵染并不一定导致作物显著减产, 但是黄曲霉 毒素污染可造成巨大的经济损失. 黄曲霉毒素是一 类具有相似分子结构和理化性质的化合物(图1), 也是迄今发现的理化性质最稳定的真菌毒素. 1993 年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的国际癌症 研究机构(IARC)划定为Ⅰ级致癌物,是一种毒性 极强的物质[9] . 据联合国粮食及农业组织(n,FAO)报道[7] ,全球每年 约有 25%的农作物遭受霉菌及其毒素的污染,其 中约 2%的农产品因毒素污染超标而失去利用价 值. 在美国, 每年真菌毒素污染造成的平均经济损 失约为 10 亿美元,其中黄曲霉毒素污染造成的损失 占很大比例[10] .尽管亚洲和非洲等发展中国家的黄 曲霉毒素污染所造成的经济损失没有准确的统计数 据, 但应该比美国严重得多[8] , 由此估计全球每年因 毒素污染而造成的直接或间接经济损失达数百亿美 元.人类和动物食用被黄曲霉毒素污染的食物,可 致畸、致突变、致癌,甚至导致死亡[11-18] .印度和 肯尼亚等国家均发生过多起因黄曲霉毒素急性中毒 一次性导致数百人死亡的恶性食品安全事件[13] . 随着分子生物学新理论和新技术的发展, 尤其 是基因组学和生物信息学等研究的快速发展, 曲霉 菌的研究、防控与应用的深度和广度进一步拓展. 黄曲霉毒素、 环匹阿尼酸、 黄曲霉震颤素等有毒次 级代谢物的生物合成都被重点研究, 尤其是黄曲霉 毒素的生物合成途径已得到较为全面的阐释[19-24] . 本文拟评述黄曲霉菌基因组学研究概况、 有毒次级 代谢物的生物合成与调控的研究进展, 旨在为深化 黄曲霉有毒物质次级代谢分子机制及其寄主抗性 遗传改良的研究提供参考. 1 黄曲霉基因组学研究概况 2003 年6月,"真菌基因组计划"选择了 44 种 真菌开展全基因组测序, 优先开展了与植物和人类 致病菌相关的 10 个属,即青霉(um)、曲霉 ()、组织胞浆菌(sma)、球孢子菌 ()、镰刀菌(Fusarium)、脉孢菌 王后苗等: 黄曲霉菌主要真菌毒素次级代谢与调控的研究进展 tp://./ 图1黄曲霉毒素化学结构式 Figure 1 Chemical
注:黄曲霉毒素化学结构式均来源于 SIGMA 网站(/n d.html)(). Note: The chemical
of the om the SIGMA web site (/ml) (). (Neurospora) 、 假丝酵母(Candida) 、 裂殖酵母()、隐球酵母()和 锈病菌(ia)属真菌的测序.自2004 年公布构 巢曲霉( ns)基因组信息开始, 研究 者们至今已完成米曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、烟曲 霉、土曲霉、黑曲霉、棒曲霉、酱油曲霉和白曲霉 9 种曲霉属真菌基因组的测序(表1).尽管所有曲霉属 真菌都有 8 条染色体,但基因组大小存在差异(表1)[25-26] .2009 年,J. Craig Venter 研究所公布了黄 曲霉菌(A. )的全基因组序列信息,基因组大 小约 37 Mb,含有 13 000 多个功能基因[27-28] .串 联基因的额外复制导致黄曲霉菌和米曲霉菌的基 因组较大, 如烟曲霉(约30 Mb)、 土曲霉(30 Mb)和黑 曲霉(34 Mb)等均比黄曲霉菌和米曲霉菌的小[29-30] . 随着研究的发展和深入,相关网站(/genomics/, NCBI, //asperghome 等)对黄 曲霉菌基因组序列信息予以更新[31] .黄曲霉菌基 因组信息为真菌功能基因组学的研究提供了平台, 为有害次级代谢物合成机制的阐释、新抗菌药物的 研发、 作物抗性遗传改良、 黄曲霉菌相关疾病(病害) 的预防和治疗,以及黄曲霉毒素污染的防控提出了 新战略方向.有趣的是,黄曲霉是一种缺乏 DNA 甲基化的物种[32] ,其他已发现缺乏 DNA 甲基化的 物种还有果蝇( melanogaster)、面粉甲虫 () 、 酿酒酵母( cerevisiae) 、 粟酒裂殖酵母( )和秀丽隐杆线虫(Caenorbabditis elegans)[33] . 基因组测序研究表明, 黄曲霉菌和米曲霉菌是 同一种真菌, 米曲霉菌是黄曲霉菌人工驯化得到的 一个亚种[34] .大部分丝状真菌的端粒重复序列是 TTAGGG,而黄曲霉菌和米曲霉菌具有相同的特 异性端粒重复序列(A)[35-36] .但是,黄曲霉菌和米曲霉菌的 ITS 序列具有特异性, 1428 微生物学通报 l. China 2014, Vol.41, No.7 ./ 表1曲霉属真菌全基因组测序基本信息 Table 1 n of
测序菌株 g 基因组大小 Genome size (Mb) GC percent (%) 基因数目 r
蛋白数目 r s 黄曲霉
NRRL 48.4 13 485 13 485 构巢曲霉
ns FGSC A4 29.83 50.4 10 597 10 534 米曲霉
oryzae RIB40 37.12 48.3 25 272 24 880 米曲霉
oryzae 3.042 36.58 48.3 11 640 11 397 烟曲霉
Af293 29.39 49.8 9 969 9 650 烟曲霉
A 49.5 10 176 9 948 烟曲霉
AF210 28.90 49.3 53 20 土曲霉
NIH 52.9 10 551 10 401 黑曲霉
niger CBS513.88 34.01 50.4 11 408 11 182 黑曲霉
CC 50.3 10 947 10 950 棒曲霉
NRRL1 27.86 49.2 9 379 9 121 酱油曲霉
sojae NBRC 48.1 C C 白曲霉
hii IFO 49 11 488 11 491 注:表中曲霉属真菌基因组测序信息均来源于 NCBI 网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)(). Note:
Table om the NCBI website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/) (). 可以作为有效区分这两种曲霉菌的标记[37] .黄曲 霉菌和米曲霉菌的比较基因组学研究发现, 黄曲霉 菌仅有 306 个特异基因,米曲霉菌的特异基因有 332 个,而这些差异基因的功能目前还不明确[34] . 尽管这两种曲霉菌的大部分次级代谢基因簇是相 同的,但是黄曲霉菌能产生 AFT 和CPA 等多种有 毒的次级代谢物, 而米曲霉菌则是安全的食品微生 物, 不会产生对人类有毒有害的次级代谢物, 因而 在食品发酵工业中具有广泛应用[38] . 2 次级代谢基因簇 一般来说, 次级代谢物是生物生长到一定阶段 才产生的化学结构复杂、 对该生物无明显生理功能 或并非是该生物生长和繁殖所必需, 但对其它生物 存在明显生理活性的物质,如生物碱、毒素、抗生 素、 色素等. 这些生物活性物质对人类或是有害(如 黄曲霉毒素)或是有利(如洛伐他丁). 不同生物产生 的次级代谢产物不尽相同,有的积累在生物细胞 内,有的则分泌到外界环境中.研究表明,在实验 室培养条件下, 次级代谢产物几乎不会影响真菌的 生长和繁殖[38] ,但在自然环境中,真菌的次级代 谢物具有防御(如防 UV、防捕食)的作用[39] . 次级代谢基因在基因组中通常成簇分布, 每一 个次级代谢基因簇包含次级代谢物合成所需酶的 编码基因和转录调控因子, 一个次级代谢基因簇能 单独调控该次级代谢途径[40] .黄曲霉菌基因组包 括25 个聚酮合成酶(PKS)基因、3 个类聚酮合成酶 (类聚酮合成酶不包含 PKS 所包含的所有典型结构 域)基因、18 个非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因、 14 个类非核糖体多肽合成酶(类非核糖体多肽合成 酶不包含 NRPS 包含的所有典型结构域)基因、2 个PKS-NRPS 基因和 8 个异戊烯基转移酶基因. 这些关键酶与其他酶类共同作用合成聚酮化合物 (PKS)、非核糖体多肽(NRPS)、PKS-NRPS 杂合物 和吲哚生物碱(二甲基丙烯基转移酶,DMATS)等次 级代谢物[41-42] .PKS、NRPS 等合成的关键酶对次 级代谢基因簇的表达及其表达水平起主要调控作 用.黄曲霉菌中存在 55 个次级代谢基因簇(表2), 但其中只鉴定并明确了 AFT、CPA 和黄曲霉震颤 素3个次级代谢基因簇及其特征[8] . 王后苗等: 黄曲霉菌主要真菌毒素次级代谢与调控的研究进展 tp://./ 表2黄曲霉菌的次级代谢基因簇[34] Table 2
[34] 基因簇编号 mber 定位 n 关键酶类 Backbone enzyme 基因数目 eA 调控 n 次级代谢物
1 IV R PKS 9 Yes 2 IV R DMAT 8 No 3 IV R NRPS 1 NA 4 IV R NRPS 4 Yes 5 IV R PKS 3 Yes 6 VIII L NRPS 12 Yes 7 VIII S-like 10 Yes 8 VIII S 9 No 9 VIII L 2NRPSs,铁载体 10 No 10 IV L Arp1 分生孢子色素 3 No 色素 11 II ke 11 Yes 12 II ke 3 Yes 13 VII L NRPS 4 No 14 VII ke 铁载体 2 No 15 VII L DMAT 12 Yes 16 VII L sidA/sidR,铁载体 1 No 17 I L ke 9 No 18 I ke 6 No 19 V L DMAT 6 Yes 20 V L 2PKS 10 No 21 VI R ke 36 Yes 木霉素 22 VI R NRPS 6 Yes 23 VI R S 17 Yes 24 VI S 3 Yes 25 VI ke 8 Yes 青霉素 26 I ke 12 No 27 I R PKS 5 Yes 28 I ke 5 No 29 I R DMAT 2 No 30 V R DMAT,NRPS 6 Yes 31 V ke 14 Yes 32 V R GGPP 19 Yes 黄曲霉震颤素 33 V S 8 No 34 VI L NRPS 8 No 35 VI ke 5 Yes 36 III ke 7 No 37 III ke 3 No 38 III L PKS 3 No 39 III L PKS 5 No 40 III L PKS 9 No 41 VII R PKS 3 No 42 VIII R PKS 11 No 43 VIII ke,DMAT 18 Yes (待续) 1430 微生物学通报 l. China 2014, Vol.41, No.7 ./ (续表) 44 VIII R PKS 5 No 45 VIII ke 16 Yes 46 VIII R 2PKS 4 No 47 VIII ke 5 No 48 VIII ke 19 Yes 49 II ke 6 No 50 II L PKS 7 Yes 51 II L PKS 5 No 52 II L PKS 7 Yes 53 III R NRPS 8 No 54 III R PKS 30 Yes 黄曲霉毒素 55 III S-NRPS 4 Yes CPA 注:LaeA 调控是指至少对一个次级代谢基因簇中的两个基因的表达具有上调或下调的作用. NA:暂时还没有获得可利用的分析数据. Note: ed based on up-
microarrays. NA: No ble. 2.1 黄曲霉毒素代谢基因簇 黄曲霉毒素是一类聚酮衍生物,调控其合成的是 第54 号次级代谢基因簇,位于黄曲霉菌 3 号染色体 端粒附近的一个次级代谢基因簇(图2)[43] . 黄曲霉毒素 合成的起始物质是乙酰辅酶 A (乙酰 etyl- CoA)和丙酰辅酶 A (丙酰 A),起 始物质在脂肪酸合成酶(Fasα,Fasβ)的作用下形成己 酸盐(e)[44-45] .降散盘衣酸(id, NOR)是黄曲霉毒素合成的第一种稳定的前体物 质[46] , 可进一步转化形成杂色曲霉素(,ST)和黄曲霉毒 素( , AFT).NOR 的合成必需依赖于黄曲霉毒素基因簇 中aflA 基因、aflB 基因(脂肪酸合成酶基因)[47] 和aflC 基因(聚酮合酶基因)[48] . 虽然黄曲霉毒素次级 代谢基因簇具有保守性,但在 A. [49] 、 A. 、A. oryzae[50] 和A. sojae[51] 等真菌中存在不同 程度的变异, 其中只有曲霉属真菌代谢产生黄曲霉毒 素或相关的杂色曲霉素. aflR 基因编码的 Zn( ) 2Cys6 Ⅱ 型转录因子识 别并结合黄曲霉毒素/杂色曲霉素生物合成基因的 启动子序列(5′-TCGN5CGR-3′),调控黄曲霉毒素/ 杂色曲霉素生物合成基因的表达[52-53] . aflR 基因过 量表达可增加黄曲霉毒素的合成量, 提高毒素生物 合成途径其他基因的表达水平, 且aflR 基因突变体 的黄曲霉毒素/杂色曲霉素生物合成基因不表达, 检 测不到黄曲霉毒素/杂色曲霉素等产物[52,54-55] .aflS 基因编码产物,通过激活 AflR 来调控黄曲霉菌和 寄生曲霉菌的黄曲霉毒素合成[56] . 黄曲霉毒素基因簇存在大片段缺失、 基因簇重 排和点突变等多种变异形式[57-59] .虽然米曲霉(A. oryzae)和酱油曲霉(A. sojae)等常用食品发酵菌种 也有黄曲霉毒素次级代谢基因簇,但A. oryzae 和A. sojae 没有黄曲霉毒素的合成[60] .A. oryzae (s) aflR 基因缺失[50] ,且A. sojae ( 477) aflR 和(或) aflS 缺失[51] . 这些表明, aflR 和(或) aflS 的缺失或无义突变,可能是 A. oryzae 和A. sojae 不能合成黄曲霉毒素的原因. 2.2 环匹阿尼酸代谢基因簇 环匹阿尼酸(id,CPA)是一种吲 哚衍物(rived ergot alkaloids)(图3),是曲霉 属和青霉属的几种真菌次级代谢产生的一种真菌毒 素[61] ,是骨骼肌质浆网 Ca2+ -ATP 酶的专化性抑制 剂[62] . CPA基因簇大小24 kb, 包含有编码PKS-NRPS 杂合物、吲哚生物碱( 二甲基丙烯基转移酶, ,DMAT)、单胺氧 化酶()和转录因子的 4 个基因, 位 于黄曲霉菌 3 号染色体的端粒端,与黄曲霉毒素基 因簇相距约 100 kb (图4)[61,63] .DMAT、单胺氧化酶 是黄曲霉菌合成 CPA 的必需因子,PKS-NRPS 在CPA 的合成过程中也具有重要作用[63-65] . 王后苗等: 黄曲霉菌主要真菌毒素次级代谢与调控的研究进展 tp://./ 图2黄曲霉菌黄曲霉毒素代谢基因簇和黄曲霉毒素合成途径[23] Figure 2
biosynthetic pathway[23] 注:黄曲霉菌的黄曲霉毒素代谢基因簇约含有 30 个不同基因,位于 3 号染色体的端粒端,与CPA 基因簇间隔较近. 每个基因的 新名称标识在图例的左侧,旧名称标识在右侧. Note:
posed y 30
and ed omere of chromosome 3, o- om the CPA cluster. s for each own on the left and s on . NOR: AVN: ; HAVN: ; OAVN: ; AVNN: ; AVF: ; VHA: nal hemia- VAL: VERB:
A; DMST: ; T: Dihydro- ; ST: ; DHST: ; OMST: ; T: Dihy- dro-; AFB1:
G2. 1432 微生物学通报 l. China 2014, Vol.41, No.7 ./ 图3环匹阿尼酸和黄曲霉震颤素的化学结构式 Figure 3 Chemical
of id rem 注:环匹阿尼酸和黄曲霉震颤素化学结构式来源于 SIGMA 网站(/ml)(). Note: The chemical
id om the SIGMA web site (http://www.sigmaaldrich. com/ml)(). 图4环匹阿尼酸次级代谢基因簇[63] Figure n of the CPA
NRRL 3357[63] 注:CPA 基因簇与 AFT 基因簇相邻,其中 norB 是AFT 基因簇中与 CPA 基因簇相邻的基因. 红色标识的基因为环匹阿尼酸基因 簇的基因. Note: The CPA cluster om
cluster, and the norB gene marks the end of
gene cluster.
red. 2.3 黄曲霉震颤素代谢基因簇 黄曲霉震颤素(rem)是由曲霉() 和青霉(um)次级代谢产生的一种吲哚二萜 类真菌毒素(图3),具有致肿瘤特性[66-67] .黄曲霉 震颤素合成基因簇位于两个不相邻的基因座(ATM1 和ATM2)[68] ,但不同曲霉菌的黄曲霉震颤 素基因簇的结构存在一定的差异(图5).其中 ATM1 基因簇位于 5 号染色体的端粒区,包含 mC 和atmM 三个基因;ATM2 基因簇位 于7号染色体上,包含 mA 和atmP 五个基因(图5). atmG 编码产生的牛儿基 二磷酸(e,GGPP)是四环 二萜的核心结构[34] .e 是黄曲霉震颤素的 前体物质,化学性质稳定,atmC 编码的异戊烯转 移酶与 mB 是e 合成的必需 物质. 3 主要有毒次级代谢物合成的调控 3.1 次级代谢全局性调控因子 LaeA 蛋白是曲霉属真菌和其他丝状真菌 (um spp.和Fusarium fujikuroi 等)次级代谢 的全局性调控因子[69-73] .LaeA 是在 aflR 基因缺失 的A. ns 突变菌株中发现的一种蛋白,是异 质三聚体(plex , plex)的重要组成成分[70-74] . LaeA 发生组 蛋白修饰, 增加了染色体重组的激活物, 从而激活 次级代谢基因簇的表达[75-76] . LaeA 和VeA 是影响黄曲霉菌感染寄主作物和 黄曲霉毒素污染的重要蛋白因子[77-79] .LaeA 调控 AFT、CPA、曲酸、黄曲霉震颤素等 24 个次级代 谢基因簇的表达[79] ;VeA 调控 AFT、CPA 和黄曲 霉震颤素的生物合成[80] .菌核是黄曲霉菌越冬的 形态, 对该病害发生周期的循环具有重要作用, 并 王后苗等: 黄曲霉菌主要真菌毒素次级代谢与调控的研究进展 tp://./ 图5曲霉菌黄曲霉震颤素次级代谢基因簇及其比较[67] Figure 5 Physical M1 (A) M2 (B)
(NRRL6541, NRRL3357) and A. oryzae (RIB40) and om
[67] 注: 红色标识的基因为黄曲霉震颤素合成基因, 阴影所标识的部分为不同曲霉菌的同源基因. A 和B分别为黄曲霉菌(NRRL6541, NRRL3357)和米曲霉菌(RIB40)为的 M2 基因簇,其他图例所示为另外几种曲霉菌的黄曲霉震颤素合成基因簇. Note: nes of panels A and
NRRL6541, A.
NRRL3357, and A. oryzae RIB40.
red, and homology exists over vered aded bands. 且菌核也能分化形成分生孢子和子囊孢子. 研究发 现,laeA 或veA 发生无义突变的黄曲霉菌突变株 不仅降低了 AFT、CPA 和黄曲霉震颤素的生成量, 并且抑制了菌核的形成;与之相反,laeA 或veA 的过 量表达增加了黄曲霉毒素合成量和菌核数量[78-81] . 3.2 脂氧合物 脂质是真菌-寄主互作过程中的重要信号分 子[82-83] .黄曲霉菌与其寄主作物(花生、玉米等)均 含有高水平的亚油酸(C18:2)和油酸(C18:2)等不饱 和脂肪酸[84-85] . 脂氧合酶催化不饱和脂肪酸产生脂 氧合物,脂氧合物(s)是丝状真菌、酵母、 卵菌、 植物和动物信号转导途径的重要信号分子[86] . Ppo (真菌)和lox (植物、 动物和真菌)编码合成 的加氧酶类及其氧化产物(脂氧合物,s)具 有调控黄曲霉菌分生孢子、菌核和次级代谢的作 用[87-88] .在构巢曲霉(A. ns)中首次发现了由 Ppo 蛋白催化产生的脂氧合物(性早熟诱导因子, psi)[89] .黄曲霉菌有 4 种双加氧酶(PpoA、PpoB、 PpoC 和PpoD)和一种脂氧合酶(LoxA)[88,90] ,ppoA 编码合成 5,8-亚油酸双氧合成酶(PpoA),ppoC 编1434 微生物学通报 l. China 2014, Vol.41, No.7 ./ 码亚油酸-10R-双氧合成酶(PpoC)[91-92] .Horowitz 等研究发现,ppoA 和ppoC 无义突变的黄曲霉菌 株,分生孢子量减少而菌核量增加;ppoD 无义突 变菌株的表型变化恰与 ppoA 和ppoC 突变菌株相 反,菌核量增加,分生孢子量减少[91] .4 个双加氧 酶基因(ppoA、ppoB、ppoC 和ppoD)的敲除与 lox 基因的突变, 均能导致突变菌株黄曲霉毒素含量和 菌核量的增加.ppo 和lox 突变菌株表型变化进一 步证明了脂氧合物对黄曲霉菌发育及次级代谢的 影响. 真菌的脂氧合物与动、 植物的脂氧合物结构相 似,这是脂氧合物作为曲霉-寄主互作信号分子的 重要特征[93-95] .植物来源的脂氧合物,如13S-脂 肪酸氢过氧化物()和9S-脂肪酸氢过氧 化物(),不仅参与植物生长发育和防御 反应, 而且影响黄曲霉菌、 寄生曲霉菌和构巢曲霉 的营养生长、 分生孢子和菌核的形成及次级代谢反 应[87,96] . ZmLOX3 失活的玉米植株更易受 A.
侵染,且AFT 含量增加[94] .然而,构巢曲霉表达 植物的脂氧合酶(ZmLOX3)基因可消除 ppoA 和ppoC 基因缺失引起的黄曲霉毒素含量和菌核量增 加的表型变化[94] .黄曲霉菌侵染榛子、杏仁、花 生和玉米等作物时, 会诱导黄曲霉菌 ppo 基因的表 达,而抑制寄主作物 lox 的表达[96-98] . 3.3 群体感应 群体感应(密度感应,nsing)是当菌 体的数量达到一定密度时发生的感应现象. 在一个 特定的环境中, 当菌体的数量急剧增加时, 由它所 分泌的信号分子的浓度也会相应升高, 当其达到一 个阈值时, 菌体之间就会通过发送信号来调整它们 的共同行为,对较高的细胞密度做出共同的感应. 黄曲霉菌分生孢子/菌核生长的转变是由群体密度 决定的,群体密度越高,分生孢子的生成量就越 多[88] .黄曲霉菌的群体密度不仅使分生孢子/菌核 的形成发生改变, 而且对次级代谢也有影响, 群体 密度升高反而降低黄曲霉毒素的生成量[90] .通过 对黄曲霉菌细胞感应的研究发现, 高群体密度黄曲 霉菌的提取物能够诱导黄曲霉菌形成高密度的群 体,反之亦然[90] . 3.4 水解酶 黄曲霉菌等曲霉菌代谢产生 α-淀粉酶、果胶 酶、 蛋白酶和脂肪酶等大量水解酶类, 这些水解酶 类在真菌侵染寄主作物的过程中发挥重要作用[99] .淀粉酶是淀粉水解过程中一种重要的水解 酶,在淀粉培养基上,amy1 (α-淀粉酶编码基因) 发生无义突变的黄曲霉菌菌株的生长受到抑制, 但amy1 发生无义突变的黄曲霉菌菌株在胚受损的玉 米种子上能产生黄曲霉毒素, 而无胚的玉米胚乳则 不能代谢产生毒素[100] .在玉米种子中发现了一种 14 kD 的胰蛋白酶/淀粉酶抑制蛋白,这种蛋白因子 抑制黄曲霉菌 α-淀粉酶的活性,并对黄曲霉菌分生 孢子的萌发和菌丝的生长具有抑制作用[100-101] .黄 曲霉菌 α-淀粉酶的活性影响其对寄主胚乳组织的 分解利用,从而影响黄曲霉菌的生长代谢. 果胶是植物细胞壁的重要组成成分, 是一类半 乳糖醛酸的聚合物, 所有植物病原物都能分泌产生 果胶酶[99] .黄曲霉菌至少能够分泌多聚半乳糖醛 酸酶等 3 种果胶酶, 其中由 pecA 编码的果胶酶(P2c) 与黄曲霉菌的侵染能力相关[102] .pecA 超表达的黄 曲霉菌对寄主细胞间膜系统的破损能力增强, 所以 能迅速侵染相邻的细胞,在寄主作物组织内定殖, 而pecA 发生无义突变的菌株对寄主的侵染能力降 低. 此外, 强致病性的黄曲霉菌菌株的 P2c 果胶酶、 淀粉酶和蛋白酶的活性均较高[103] .虽然脂肪酶的 活性影响寄主的发病机制[104] ,并且在黄曲霉菌和 寄生曲霉菌中已成功克隆一个脂肪酶编码基因 lipA[105] ,然而尚未见有关 lipA 表达活性是否影响 黄曲霉菌的致病性及黄曲霉毒素生成水平的研究 报道[105] . 黄曲霉菌侵染寄主作物是一个复杂而精准的 过程[106] .虽然酶活性的改变可以启动寄主的抗性 机制以抑制黄曲霉菌的生长和毒素的生成, 但酶活 性的改变并不是真菌获取生存所需营养物质的限 制性因素[31] . 王后苗等: 黄曲霉菌主要真菌毒素次级代谢与调控的研究进展 tp://./ 4 结论与展望 黄曲霉菌在自然界中分布广泛, 是人、 动物及 植物的共同病原菌, 黄曲霉菌感染及黄曲霉毒素污 染不仅严重制约农业生产的发展, 而且是危及食品 安全和人类健康的重要因素. 黄曲霉菌广泛存在于 环境中, 黄曲霉菌生境中的其他微生物对黄曲霉菌 生长及代谢是否存在影响?其他微生物是促进还 是抑制黄曲霉菌侵染寄主和毒素生成?无毒黄曲 霉菌能够有效防控黄曲霉毒素污染的发生[34] ,但 无毒菌株是否是通过改变黄曲霉菌周际的微生物 群体来控制毒素污染?在已有研究基础上, 继续探 讨黄曲霉代谢及防控中的问题, 有助于我们对黄曲 霉菌全面正确的认识, 为防控黄曲霉菌侵染和毒素 污染开辟新的途径. 黄曲霉菌基因组大小约 37 Mb,含有 13 000 多个功能基因,55 个次级代谢基因簇,次级代谢 基因簇的表达受不同环境条件、次级代谢调控因 子、 酶活性、 复杂的脂氧合物转导信号及群体密度 效应的调控.目前,仅明确了 AFT、CPA 和黄曲 霉震颤素 3 个次级代谢基因簇及其特征, 其他大多 数次级代谢基因簇的结构与特性仍不明确, 深入研 究次级代谢基因簇结构与特性对真菌毒素代谢通 径的明确及毒素污染的防控具有重要意义. 基因组测序和全基因组表达数据改变了果蝇、 拟南芥和人类传统遗传研究的方法, 黄曲霉菌基因 组测序的完成同样也改变了这一真菌的研究方法. 对黄曲霉菌基因组的研究, 有助于对不同生境下黄 曲霉菌生理特性、 形态差异、 进化和代谢多样性的 明确; 曲霉菌基因组的比对分析, 有助于未知功能 基因的发掘、 复杂行为机理的明确, 推动黄曲霉繁 殖方式的选择、基因沉默、孢子形成、次级代谢、 致病机理及其寄主-曲霉互作等领域的研究.黄曲 霉菌基因组测序的完成为曲霉菌次级代谢模式的 揭示同曲霉菌分子生物学研究的结合提供了一个 很好的切入点. 此外, 黄曲霉菌基因组信息为真菌 功能基因组学研究提供了平台, 为有害次级代谢物 合成机制的阐释、 新抗菌药物的研发、 作物抗性遗 传改良、黄曲霉菌相关疾病(病害)的预防和治疗、 以及黄曲霉毒素污染的防控提出了新战略方向. 群体感应能引起细菌和真菌的孢子形成、 次级 代谢等代谢过程的转变, 因此黄曲霉菌群体感应的 分子机制将是未来研究的新方向[107] .同样,在黄 曲霉菌侵染作物和动物的过程中, 黄曲霉菌对寄主 代谢的阻抑与应激反应及寄主对黄曲霉菌代谢的 响应等发挥着重要的作用. 随着基因敲除、 次级代 谢基因簇诱导沉默和化学物质检测技术的快速发 展, 没有功能和特征注释基因簇的研究将取得重大 突破. 次级代谢基因簇结构和功能的明确, 有助于 正确认识黄曲霉菌致病性, 并具有农业和制药业生 产应用的实践价值. 参考文献[1] Klich MA.
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