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_食品中大肠菌群的测定
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乳糖发酵检验大肠菌有时只产酸不产气是怎么回事?用乳糖胆盐发酵实验(发酵24小时,36度)检测奶粉中是否大肠杆菌超标时经常有发酵管只变黄色(产酸),而液面上及小导管中无气泡(不产气)的现
乳糖发酵检验大肠菌有时只产酸不产气是怎么回事?用乳糖胆盐发酵实验(发酵24小时,36度)检测奶粉中是否大肠杆菌超标时经常有发酵管只变黄色(产酸),而液面上及小导管中无气泡(不产气)的现象发生,在伊红美蓝平板上接种培养24小时后再去显微镜下观察,这种产酸不产气的细菌多数情况下都不是大肠菌,多为红色球菌.请问是什么原因导致这种现象?该红色球菌为何物?如何避免?有人提到空气污染的原因,这里说明一下,用乳酸熏蒸灭菌后仍然会出现该现象.在这里谢谢大家的回答,但还期望能得到更详细的答案,
请检查一下你的实验步骤和条件是否有差.大肠菌群是一群需氧和兼性厌氧的,能在37℃培养24h内使乳糖发酵产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌,包括埃希氏菌属（Escherichia）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、肠杆菌属（Enterobacte）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）等,又称总大肠菌群（total coliform）.它们随粪便进入水体后,某些菌株可适应新环境而发生后继繁殖,成为天然菌系的一部分.为把它们与粪便中的大肠菌群区分开来,将培养温度提高至44.5℃±0.2℃,在该温度下仍能生长并发酵乳糖产酸产气的称为粪大肠菌（feacal coliform）.二、步骤和方法 检测大肠菌群的标准方法有多管发酵法和膜滤法.（一）多管发酵法（即最大可能数法,most probable number,简称MPN法） 于一系列发酵管中接种一定量水样,根据乳糖发酵产酸产气的阳性管数,测知水样含大肠菌群数.1．总大肠菌群 （1）初发酵试验 以无菌操作术向各乳糖蛋白陈培养液发酵管（瓶）内注入一定量水样,混匀后置37℃温箱培养24h.产酸产气者为阳性.阴性者继续培养24h±3h再行检查.混浊而无气泡者,轻摇试管,注意观察有无小气泡上浮.有小气泡不断上浮,表示发酵正活跃,否则判为阴性.接种水样量、平行管（瓶）数参考如下：饮用水100ml,2瓶；10ml 10管 未污染水10ml、1ml、0.1ml各5管 受污染水0.1ml、0.01ml、0.001ml各5管 污水0.001ml、0.0001ml、0.00001ml各5管 这里,0.1ml即稀释10倍的水样1ml,余类推.接种水样量大（10ml、100ml）的管（瓶）内培养液应是浓缩液,使其在加入水样后为单倍浓度（普通浓度）.（2）平板分离 轻摇初发酵试验阳性管,用接种环或一端挠起的接种针以无菌操作术取上述各阳性管的培养物,分别在伊红美兰平板上划线接种,平板倒置于37℃温箱培养18h～24h.呈深紫红色、有或无金属光泽的菌落,为典型大肠菌菌落,粉红色、粘液状、不透明的为非典型菌落,其他状态的均为阴性菌落.（3）复发酵试验 取典型或非典型菌落（无典型菌落时取非典型菌落）的部分培养物作涂片,革兰氏染色,镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌,则取该菌落的另一部分培养物再接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管内,每管可接种分离自同一初发酵管的最典型菌落1个～3个.置37℃温箱培养24h,产酸产气者证实有总大肠菌群存在.（4）报告 根据证实有总大肠菌群存在的阳性管数,查表（见表5－1）,并按初发酵试验接种水样量换算后,报告每升水样的总大肠菌群数.对表中未能列入的组合,以及当试管数和稀释情况不同时,可利用托马斯（Thomas）氏公式来计算：出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
1:01:00 中国食品科技网
中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN 0169-92 代替 ZB X09 002一88Method for examination of coliform, fecal coliform and escherichia coli in food for export1　主题内容与适用范围　　本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。　　本标准适用于出口食品的检验。2　设备和材料2.1　吸管: 1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。 2.2　水浴箱：44.5±0.5℃。2.3　培养箱：36±1℃,44.5±0.5℃。2.4　冰箱: 0～5℃和-15～-20℃。 2.5　均质器。 2.6　乳钵和研棒。2.7　平皿：直径90mm。2.8　天平：感量0.1g。 2.9　显微镜。 2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。2.11 玻璃珠：直径约5mm。 2.12 菌落计数器。 3　培养基及试剂 3.1　月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。 3.2　煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。 3.3 EC 肉汤。3.4　伊红美蓝琼脂(EMB)。 3.5　营养琼脂斜面。 3.6　色氨酸肉汤。 3.7 MR-VP培养基。 3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。 3.9　结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。 3.10　Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。 3.11 生理盐水。 3.12 革兰氏染色液。 3.13 Kovacs氏靛基质试剂。 3.14 甲基红指示剂。 3.15 Voges-pros kauer(V-P)试剂。4　样品制备 4.1　以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2～5℃ 18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。4.2　不同食品样品匀液的制备 4.2.1　液体食品 以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠), 以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。4.2.2　固体和半固体食品　　以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。 4.3　稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。 5　大肠菌群的测定 5.1　大肠菌群MPN值的测定 5.1.1　对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。 5.1.2　将接种管置于36±1℃培养48±2h。 5.1.3　观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者,则进一步作证实试验。 5.2　大肠菌群的证实试验 5.2.1　将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。5.2.2　置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。 5.2.3　记录所有BGLB肉汤管的产气管数。 5.2.4　结果报告：按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B (补充件)]报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。6　粪大肠菌群测定 6.1　用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。 6.2　将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。6.3　记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。6.4　结果报告：按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。7　大肠杆菌测定7.1　将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。 7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。7.3　如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h。 7.4　将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。7.4.1　色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。7.4.2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。　　将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长 。7.4.4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。7.4.5　革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。 7.4.6　大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：靛 基 质 MR
枸椽酸盐 鉴定(型别)
典型大肠杆菌 －
非典型大肠杆菌 ＋
典型中间型 －
非典型中间型 －
典型产气肠杆菌 ＋
非典型产气肠杆菌 　　如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做 重复试验。7.5　结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋ －－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN 值。8　大肠菌群固体培养基测定法8.1　样品制备同第4章。8.2　计数8.2.1　选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。8.2.2　将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。8.2.3　待琼脂凝固后,再加3～4mL VRBA覆盖平板表层。8.2.4　翻转平板,置于36±1℃培养18～24h。8.2.5　选用有30～150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。8.2.6　证实8.2.6.1　从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内, 36±1℃培养24h和48h,观察产气情况。8.2.6.2　将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。8.2.7　结果报告　　经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌) 的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。　　例：10**-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为：　　100×6/10×10**-4/g(mL)＝6.0×10**5/g(mL)附　录 A　 　　　　　　　　　　　　　　培养基和试剂 　　　　(补充件)A1　月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤　　胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase)　　20g 　　氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　5.0g　　乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g　　磷酸氢二钾(K2HPO4)　　　　　　　　　2.75g 　　磷酸二氢钾(KH2PO4)　　　　　　　　　2.75g　　月桂基硫酸钠　　　　　　　　　　　　0.1g　　蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　1000.0mL　　将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。A2　煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤　　蛋白胨 　　　　　　　　　　　　10.0g　　乳糖　　　　　　　　　　　　　 10.0g　　牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液　　200.0mL 　　0.1％煌绿水溶液　　　　　　　　13.3mL 　　蒸馏水　　将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中,pH7.0～7.5),用蒸馏水稀释到975mL,调pH7.4。再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH7.2±0.1。A3 EC肉汤　　胰蛋白(月示)或胰酪(月示) 20.0g　　3号胆盐或混合胆盐　　　　 1.5g 　　乳糖　　　　　　　　　　　 5.0g　　磷酸氢二钾(K2HPO4)　　　　4.0g 　　磷酸二氢钾(KH2PO4)　　　　 1.5g　　氯化钠　　　　　　　　　　5.0g 　　蒸馏水　　　　　　　　 1000.0mL 　　将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL。121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.1。A4　伊红美蓝琼脂(EMB)　　蛋白胨　　　　　　 10.0g 　　乳糖 　　　　　　　10.0g 　　磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.0g 　　琼脂　　　　　　　 15.0g　　伊红γ(水溶性)　　　　　　　　 0.4g或2％水溶液20mL 　　美蓝　　　　　　　　　　　 0.065g或0.5％水溶液13mL 　　蒸馏水　　　　　　　　　　　　 1000.0mL　　在1000mL蒸馏水中煮
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