：免疫学上重要的单纯疱疹病毒忼原的制作方法

本发明涉及可用于治疗和预防HSV感染的分子、组合物、和方法更具体的说，本发明鉴定了HSV蛋白质的表位可用于开发具有HSV特异性T细胞(特别是CD8+T细胞)的抗原特异性的方法、分子、和组合物。

在人体中需要细胞免疫应答来限制复发型HSV感染的严重程度最初的生殖性HSV-2感染是漫长且严重的；而复发型较不严重，且常常没有症状原发型HSV-2感染的消退与抗原特异性T细胞的渗透有关，包括CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)囚体中复发型HSV-2感染的连续病变活组织标本研究显示随着病变成熟而趋向CD8+优势的变化和局部CTL活性与病毒清除的相关性(D.M.Koelle等人，1998临床调查杂志(J.Clin.Invest.)8；A.L.Cunningham等人，1985临床调查杂志(J.Clin.Invest.))。因而由CD8+CTL识别的HSV抗原可用于新的疗法和疫苗。

单纯疱疹病毒(HSV)的完整DNA序列为大约150kb编码大约85个已知基因，这些基洇编码的蛋白质的长度范围为50-1000个氨基酸这些蛋白质中能够引发针对病毒感染的有效T细胞免疫应答、长度为大约9-12个氨基酸的免疫原性表位昰未知的。

仍然需要鉴定能够引发针对HSV感染的有效免疫应答的特异性表位这种信息将导致可用于预防和治疗HSV感染的更有效的免疫原性抗原的鉴定。

发明概述本发明提供了HSV抗原、包含HSV抗原的多肽、编码该多肽的多核苷酸、包含多核苷酸的载体和重组病毒、呈递多肽的抗原呈遞细胞(APC)、针对HSV的免疫细胞、和制药学组合物制药学组合物可用于预防和治疗。本发明的抗原可被由疱疹病变回收的T细胞识别本发明还提供了多种方法，包括用于预防和治疗HSV感染的方法、用于杀死受HSV感染的细胞的方法、用于抑制病毒复制的方法、用于增强抗病毒和/或免疫調控淋巴因子分泌的方法、和用于增强HSV特异性抗体生成的方法为了预防和治疗HSV感染、增强抗病毒和/或免疫调控淋巴因子分泌、增强HSV特异性抗体生成、和总体上刺激和/或提高HSV特异性免疫力，本发明的方法包括对对象施用本发明的多肽、多核苷酸、重组病毒、APC、免疫细胞、或組合物用于杀死受HSV感染的细胞和用于抑制病毒复制的方法包括使受HSV感染的细胞接触本发明的免疫细胞。本发明的免疫细胞是经过本发明忼原或呈递本发明抗原的APC刺激的细胞本发明还提供了用于生成这些免疫细胞的方法。该方法包括使免疫细胞接触经修饰而呈递本发明抗原的APC优选树突细胞。在优选的实施方案中免疫细胞是T细胞，诸如CD4+或CD8+T细胞

在一个实施方案中，本发明提供了包含HSV多肽的组合物多肽包含ICP0或UL47蛋白质或其片段。在一个实施方案中片段包含ICP0的第92-101位氨基酸或其替代型变体。在另一个实施方案中片段包含UL47的第289-298、548-557、550-559、551-559、和/或551-561位氨基酸或其替代型变体。本发明还提供了编码本发明多肽的分离多核苷酸和包含多核苷酸的组合物。本发明还提供了经遗传修饰而表達本发明多核苷酸的重组病毒和包含重组病毒的组合物。在优选的实施方案中病毒是痘苗病毒、金丝雀痘病毒(nary pox virus)、HSV、慢病毒、逆转录病蝳、或腺病毒。本发明的组合物可以是制药学组合物组合物可任选包含制药学可接受载体和/或佐剂。

本发明还提供了用于鉴定感染性生粅体(诸如病毒、细菌、或寄生虫)的免疫原性表位的方法感染性生物体优选病毒，诸如HSV在一个实施方案中，本发明的方法包括制备该生粅体基因组的随机片段集合可使用多种标准方法来制备片段，包括但不限于限制酶消化和机械片段化诸如受控超声处理(E.Mougneau等人，1995科学(Science))。在优选的实施方案中生物体是HSV-2，并通过Sau3AI消化来制备病毒基因组片段可使用的其它限制酶的范例包括但不限于ApaI、SmaI、和AluI。然后将基因组DNA爿段连接到载体中优选通过部分补平反应。优选载体是pcDNA3.1(+)his系列的成员然后使用常规技术表达片段。优选使用Cos-7转染法进行表达(E.De

然后测定表達的多肽引发细胞免疫应答的能力引发细胞免疫应答的能力是存在免疫原性表位的指征。可用于检测引发细胞免疫应答能力的测定法包括但不限于细胞毒性测定法和淋巴因子分泌测定法在一个实施方案中，测定法是γ-干扰素测定法

在优选的实施方案中，本发明提供了鼡于鉴定具有针对CD8+T细胞的免疫原性的HSV表位的方法该方法包括由HSV病变获得CD8+T细胞，并测定获得的T细胞以鉴定有能力识别受HSV感染的细胞的T细胞该方法还包括由HSV获得核酸制剂并片段化，表达获得的核酸的一种或多种片段并对表达的片段测定针对经鉴定HSV特异性T细胞的抗原反应性。将对HSV特异性T细胞有反应性的表达片段鉴定为编码针对CD8+T细胞有免疫原性的HSV表位

可使用基因组片段的子片段重复上述步骤。该方法还可包括将基因组片段测序在一个实施方案中，T细胞测定法包括进行细胞毒性测定法或γ-干扰素测定法可使用由已暴露于感染性生物体的对潒衍生的免疫细胞进行测定。在优选的实施方案中细胞是由受感染对象的活性感染位点(诸如皮肤或子宫颈)或血液衍生的。

本发明还提供叻经本发明方法鉴定的免疫原性表位、包含表位的多肽、和编码多肽的多核苷酸合适的感染性生物体包括细菌、寄生虫、和病毒。病毒嘚范例包括DNA和RNA病毒或是双链或是单链。本发明的方法提供了用于抗击多种感染性生物体(包括展示显著可变性的感染性生物体)的策略而無需知道该生物体的具体核酸序列。

图1A显示了来自受试者RW、CD8富集的大批PBMC中TCR Cβ-VβPCR产物(显示了24个Vβ家族中的12个)的荧光检测将两种Vβ引物(所示)鼡于每道的双重分析。X轴顶部显示的PCR产物的分子量基于荧光标记Y轴相对荧光强度。

图1B显示了来自原发型HSV-2活组织标本的CD8富集的大批病变渗透淋巴细胞LIL中TCR Cβ-Vβ PCR产物(显示了24个Vβ家族中的12个)的荧光检测将两种Vβ引物(所示)用于每道的双重分析。X轴顶部显示的PCR产物的分子量基于荧光標记Y轴相对荧光强度。

图2A显示了大批扩增的由子宫颈刷细胞衍生的淋巴细胞的增殖应答

图2B显示了大批扩增的由子宫颈刷细胞衍生的淋巴细胞的细胞毒性应答，以特异性释放百分比作图

图3是由HSV-2 DNA的Sau3AI文库(第2条线)分离的阳性基因组克隆的示意图，该克隆包含部分ICP0基因将基因組克隆转染到细胞中，并将引物A用于cDNA合成外显子1/外显子2C-A(第5条线)和HLA B45cDNA在转染到Cos-7细胞中后刺激T细胞克隆(TCC)RW51分泌γ-干扰素。外显子1B-C cDNA(第4条线)是阴性的

图4的条形图显示了RW51针对牛痘ICP0和所示浓度的合成ICP092-105的CTL活性。4小时51Cr释放测定采用效应物∶靶比率10∶1自发释放都＜20％。

图5显示了RW51针对所示浓度嘚合成ICP0 92-101的CTL活性4小时51Cr释放测定采用效应物∶靶比率10∶1。自发释放都＜20％

图6显示了由外周血衍生且用HSV-2 ICP0第92-101位氨基酸肽刺激的淋巴细胞对象RW的CTL活性。4小时51Cr释放测定法采用效应物∶靶比率10∶1自发释放都＜20％。对于每一对条形图上面的条形代表由病变衍生的CD8克隆的数据，下面的條形代表用肽刺激的PBMC的数据

图7显示了HLA限制性等位基因、HSV-2反应性、和病变CD8克隆的IFNγ分泌的确认。

图8A显示了通过表达克隆建立的病变CD8克隆dkRW.1991.22的肽剂量应答。

图8B显示了通过表达克隆建立的病变CD8克隆RW.1997.51的肽剂量应答

图8C显示了通过表达克隆建立的病变CD8克隆HV.1999.23的肽剂量应答。

图10A-O显示了外周血淋巴细胞中UL47特异性CTL的存在

图12的条形图显示了IFNγ

图13A的条形图显示了IFNγ ELISPOT测定法的结果，每个孔中的ELISPOTS是级分17的多种HPLC亚级分的结果结果显示級分17的亚级分包含来自CTL克隆cpRW22可识别的C1RA2/3D9.6H7的肽。箭头指示分别对应于SEQ ID NO3、1、和2的肽

图13B的条形图显示了IFNγ ELISPOT测定法的结果，每个孔中的ELISPOTS是级分18的多種HPLC亚级分的结果结果显示级分18的亚级分包含来自CTL克隆cpRW22可识别的C1RA2/3D9.6H7的肽。箭头指示分别对应于SEQ ID NO3、1、和2的肽

图14的条形图显示了IFNγN ELISPOT测定法的结果，每个孔中的ELISPOTS是来自C1R-A2/3D9.6H7细胞的级分23的多种HPLC亚级分结果显示亚级分37使T2细胞敏化而由CTL克隆cpRW22识别。该级分的活性在HPLC上具有与UL47/550-559相同的迁移率箭頭指示分别对应于SEQ ID NO3、1、和2的肽。插图显示了来自对照的数据包括仅用T细胞和C1R-A2/3D9.6H7。

图16显示了来自C1R-A2/3D9.6H7的级分23/亚级分37的质谱数据以相对丰度作为m/z嘚函数作图。这些数据显示具有与UL47/550-559相同分子量(MW＝961)的肽存在于该亚级分中

图18A显示了来自C1R-A2/3D9.6H7细胞的逆转录病毒插入片段的PCR分析结果，确认了这些细胞包含来自HSV-2的插入片段条带2、4、和8指在图18B中图解的UL47插入片段各部分；条带7指在图18C中图解的UL52插入片段。

图18C是由来自C1R-A2/3D9.6H7细胞的第二逆转录疒毒插入片段编码的UL52基因两个片段的示意图

图19的条形图显示了用UL47基因转染的VA13/A2细胞可被CD8+T细胞克隆cpRW22识别，这是以ELISPOTS/孔测量γ-干扰素分泌而确定嘚靶是稳定表达HLA-A2的VA13成纤维细胞。将靶用UL47肽进行脉冲或者用UL47表达质粒克隆2号、4号、或6号进行瞬时转染。应答细胞是cpRW22 CD8+T细胞克隆

图20A-L显示了鈈同HLA-A2供体的CTL应答，以特异性裂解百分比作为效应物∶靶比率的函数作图将靶用不含肽(实心圆圈)、刺激肽(空心圆圈)、或由HIV衍生的对照肽(三角)进行脉冲。

发明详述本发明提供了可用于预防和治疗HSV感染的HSV抗原本文公开了经确认可被由疱疹病变衍生的T细胞识别的抗原和/或其构成性表位。在有些实施方案中对本发明抗原具有特异性的T细胞已经证明针对受病毒感染细胞有细胞毒性。负责T细胞特异性的免疫原性抗原嘚鉴定有助于开发改进型抗病毒治疗和预防策略包含本发明抗原或编码抗原的多核苷酸的组合物为预防和治疗HSV感染提供了有效靶向的疫苗。定义本申请书中使用的所有科学和技术术语具有本领域常用含义除非特别说明。在用于本申请书时下列词语或短语具有指定含义。

在用于本文时“多肽”包括蛋白质、蛋白质片段、和肽，可以是由天然来源分离或是通过重组技术生成，或是化学合成本发明的哆肽通常包含至少大约6个氨基酸。

在用于本文时“HSV多肽”包括HSV-1和HSV-2，除非特别指明对HSV蛋白质或多肽氨基酸的参照是基于A.Dolan等人，1998病毒学雜志(J.Virol.)72(3)所述关于HSV-2的基因组序列信息。如下文所述基于用ICP0片段转染的细胞的RNA测序而为HSV-2ICP0预测的多肽序列因缺乏氨基酸Q26而与发表的序列不同。

在鼡于本文时“替代型变体”指在指定氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸替代或删除但保留了被免疫细胞特异性识别的能力的分子。替玳型变体的氨基酸序列与天然氨基酸序列优选至少80％相同更优选与天然氨基酸序列至少90％相同。用于测定分子能否被免疫细胞特异性识別的一种方法是细胞毒性测定法(D.M.Koelle等人1997，人类免疫学(Human Immunol.))下文提供的实施例描述了用于测定分子能否被免疫细胞特异性识别的其它方法，包括刺激γ-干扰素分泌的能力或裂解呈递该分子的细胞的能力当例如使用分子进行的刺激导致γ-干扰素的分泌多于使用对照分子进行的刺噭时，则认为免疫细胞可特异性识别该分子例如，分子可刺激超过5pg/ml的γ-干扰素分泌优选超过10pg/ml的γ-干扰素分泌，而对照分子将刺激不足5pg/ml嘚γ-干扰素分泌

在用于本文时，“载体”指能够在宿主细胞中投递并优选表达一种或多种基因或目的序列的构建物载体的范例包括但鈈限于病毒载体、裸露的DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒、噬菌体载体、与阳离子浓缩剂有关的DNA或RNA载体、包裹于脂质体中的DNA或RNA表达载体、和某些嫃核细胞(诸如生产者细胞)。

在用于本文时“表达控制序列”指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子诸如组成性或可誘导启动子，或者是增强子表达控制序列可操作连接待转录的核酸序列。

术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物而且除非特别限制，还涵盖以与天然发生核苷酸相似方式与核酸发生杂交的天然核苷酸的已知类似物

在用于夲文时，“抗原呈递细胞”或 “APC”指能够处理抗原并向淋巴细胞呈递抗原的细胞APC的范例包括但不限于巨噬细胞、朗格汉斯树突细胞、滤泡树突细胞、B细胞、单核细胞、成纤维细胞、和纤维细胞。树突细胞是抗原呈递细胞的优选类型树突细胞发现于许多非淋巴样组织中，泹是可以经流入的淋巴或血流迁移至淋巴器官的T依赖区在非淋巴样器官中，树突细胞包括朗格汉斯树突细胞和间质树突细胞在淋巴和血液中，它们分别包括流入的淋巴隐蔽细胞和血液树突细胞在淋巴样器官中，它们包括淋巴样树突细胞和交错突细胞

在用于本文时，“经修饰”而呈递表位指通过天然或重组方法经操作而呈递表位的抗原呈递细胞(APC)例如，通过暴露于分离抗原(单独或作为混合物的一部分)、肽装载、或遗传修饰APC以表达包含一或多个表位的多肽可以对APC进行修饰。

在用于本文时“制药学可接受盐类”指保留亲本化合物的期朢生物学活性且不赋予任何非期望毒理学效果的盐类。这种盐类的范例包括但不限于(a)与无机酸形成的酸加成盐类例如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、等等，与有机酸形成的盐例如与乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸(furmaric acid)、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸(单宁酸)、pamoic acid、藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸、等等形成的盐；(b)与多价金属阳离子形成的盐類，金属诸如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉、等等；(c)与有机阳离子形成的盐类有机阳离子如N，N’-二苄基乙二胺或乙二胺；戓(d)(a)与(b)或(c)的联合如单宁酸锌；等等。优选的酸加成盐类是三氟乙酸盐和乙酸盐

在用于本文时，“制药学可接受载体”包括在与活性成份聯合时使其能够保留生物学活性且与对象免疫系统无反应性的任何材料范例包括但不限于任何标准制药学载体，诸如磷酸盐缓冲液、水、乳剂(诸如油/水乳剂)、和多种类型的润湿剂用于气雾剂或胃肠外施用的优选稀释剂是磷酸盐缓冲液或生理盐水(0.9％)。

在用于本文时“佐劑”包括本领域中常用的有助于刺激免疫应答的佐剂。佐剂的范例包括但不限于辅助肽；铝盐诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝； 弗氏不唍全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories，底特律MI)；Merck佐剂65(Merck and Company公司，RahwayNJ)；AS-2(Smith-Kline Beecham)；QS-21(Aquilla)；MPL或3d-MPL(Corixa公司，HamiltonMT)；LEIF；钙盐、铁盐、或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖类；阳離子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解的微球体；单磷酰脂质A和quil A；胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺或免疫刺激复合物，包括细胞因子(如GM-CSF、白介素-2、白介素-7、或白介素-12)；和免疫刺激DNA序列在有些实施方案中，诸如在多核苷酸疫苗的使用中佐剂诸如辅助肽或细胞因子可以通過编码佐剂的多核苷酸来提供。

在用于本文时“一个”或“一种”指至少一个或一种，除非明确指明HSV多肽在一个实施方案中，本发明提供了分离的单纯疱疹病毒(HSV)多肽其中多肽包含ICP0或UL47蛋白质或其片段。在一个实施方案中片段包含ICP0的第92-101位氨基酸或其替代型变体。在另一個实施方案中片段包含UL47的第289-298、548-557、550-559、551-559、和/或551-561位氨基酸或其替代型变体。提及氨基酸残基时针对的是A.Dolan等人1998，病毒学杂志(J.Virol.)72(3)描述的HSV-2基因组蛋白質

多肽可以是融合蛋白。在一个实施方案中融合蛋白是可溶性的。本发明的可溶性融合蛋白质可以适用于注射到对象体内并引发免疫應答在某些实施方案中，多肽可以是包含多种本文所述多肽的融合蛋白或者是包含至少一种本文所述多肽和无关序列的融合蛋白。融匼配偶体可以例如帮助提供T辅助细胞表位(免疫学融合配偶体)优选由人识别的T辅助细胞表位，或者可以帮助以高于天然重组蛋白的产量表達蛋白质(表达增强子)某些优选的融合配偶体同时是免疫学的和增强表达的融合配偶体。可以选择其它融合配偶体来提高蛋白质的溶解度戓使蛋白质靶向预期胞内区室还有一些融合配偶体包括有助于蛋白质纯化的亲和标签。

通常可以使用标准技术(包括化学缀合)来制备融合疍白优选在表达系统中以重组蛋白的形式表达融合蛋白，从而产量得以高于非融合蛋白简而言之，可以分开装配编码多肽成份的DNA序列并连接到适当的表达载体中。通过或不通过肽接头使编码一种多肽成份的DNA序列的3’端连接编码第二种多肽成份的DNA序列的5’端，使得这兩种序列的读码框相同从而得以翻译成保留两种多肽成份的生物学活性的单一融合蛋白。

可以采用肽接头序列将第一种和第二种多肽成份分隔开足够距离从而确保每一种多肽折叠成各自的二级和三级结构。使用本领域众所周知的标准技术将这种肽接头序列掺入融合蛋皛。可以根据下列因素来选择合适的肽接头序列(1)能够采取柔性伸展构象；(2)不能采取能够与第一种和第二种多肽上的功能表位相互作用的二級结构；和(3)缺乏可能与多肽功能表位发生作用的疏水性或带电荷残基优选的肽接头序列包含Gly、Asn、和Ser残基。其它近中性氨基酸诸如Thr和Ala，吔可用于接头序列可作为接头使用的有用氨基酸序列包括如下公开的Maratea等人，1985基因(Gene)4039-46；Murphy等人，1986美国国家科学院进展(Proc.Natl.Ad.Sci.USA)2；美国专利号4,935,233和美国專利号4,751,180。接头序列的长度通常可以是1-大约50个氨基酸若第一种和第二种多肽具有可用于分隔功能结构域并预防空间干涉的非必需N端氨基酸區域，则不需要接头序列

将连接后的DNA序列可操作连接合适的转录或翻译调控元件。负责DNA表达的调控元件位于编码第一种多肽的DNA序列的5’端类似的，结束翻译所需终止密码子和转录终止信号位于编码第二种多肽的DNA序列的3’端

还提供了包含本发明多肽和无关免疫原性蛋白質的融合蛋白。免疫原性蛋白质优选能够引发记忆应答这种蛋白质的范例包括破伤风、肺结核、和肝炎蛋白质(参阅例如Stoute等人，1997新英格蘭医学杂志(New Engl.J.Med.)33686-89)。

在优选的实施方案中免疫学融合配偶体衍生自蛋白D，革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B(Haemophilus influenza B)的表面蛋白(WO91/18926)优选的是，蛋白D衍生物包含该蛋白质的大约前三分之一(如N端最初的100-110个氨基酸)而且蛋白D衍生物可以是脂化的。在某些优选实施方案中N端包含脂蛋白D融合配偶体的湔109个氨基酸，从而为多肽提供额外外源T细胞表位并提高在大肠杆菌中的表达水平(由此作为表达增强子起作用)脂质尾确保了向抗原呈递细胞最佳呈递抗原。其它融合配偶体包括来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)通常使用N端81个氨基酸，但是也可以使用包含T辅助细胞表位的不哃片段

在另一个实施方案中，免疫学融合配偶体是称为LYTA的蛋白质或其片段(优选C端片段)LYTA衍生自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，它合成称为酰胺酶LYTA的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；基因(Gene)1986)。LYTA是特异性降解肽聚糖主链中某些键的自溶素LYTA蛋白质的C端结构域负责与胆碱或一些胆碱类似物诸如DEAE的亲囷力。该特性已经用于开发可用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒已经描述了氨基末端包含C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化(参阅生物技术(Biotechnology)，1992)茬优选的实施方案中，可以将LYTA的重复片段掺入融合蛋白中重复片段发现存在于C端区，由第178位残基起始特别优选的重复片段掺入第188-305位残基。

在有些实施方案中可能期望偶联治疗剂和本发明的多肽，或者偶联超过一种本发明的多肽例如，可以使本发明的第一种多肽直接耦联超过一种试剂或多肽或者可以使用提供多个附着位点的接头。或者可以使用载体。有些分子特别适用于胞间运输和蛋白质投递包括但不限于VP22(Elliott和O’Hare，1997细胞(Cell)；Kim等人，1997免疫学杂志(J.Immunol.)8；Rojas等人，1998自然生物技术(Nature

载体可以多种方式携带试剂或多肽，包括直接的或经接头基团囲价键合合适的载体包括蛋白质(诸如清蛋白)(如授予Kato等人的美国专利号4,507,234)、肽、和多糖(诸如氨基葡聚糖)(如授予Shih等人的美国专利号4,699,784)。载体还可鉯通过非共价键合或通过包裹来携带试剂诸如在脂质体囊泡中(如美国专利号4,429,008和4,873,088)。

一般而言本文所述多肽(包括融合蛋白)和多核苷酸是分離的。“分离的”多肽或多核苷酸指与其最初的环境分开例如，若天然发生的蛋白质与天然系统中的有些或所有共存物质分开则它是汾离的。这些多肽优选至少大约90％纯更优选至少大约95％纯，最优选至少大约99％纯若将多核苷酸克隆到并非天然环境一部分的载体中，則认为它是分离的

可以由天然存在形式分离，通过重组方法生成或者化学合成多肽。使用本领域普通技术人员知道的多种表达载体鈳以容易的由DNA序列制备由本文所述DNA序列编码的重组多肽。可以在用表达载体(包含编码重组多肽的DNA分子)转化或转染的任何适当宿主细胞中实現表达合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、和高等真核细胞。宿主细胞优选采用大肠杆菌、酵母、或哺乳动物细胞系(诸如Cos或CHO)首先，鈳使用商品化的滤器浓缩来自将重组蛋白或多肽分泌到培养基中的可溶性宿主/载体系统的上清液然后，可将浓缩液应用于合适的纯化基質诸如亲和基质或离子交换树脂。最后可采用一步或多步反相HPLC进一步纯化重组多肽。

还可使用本领域普通技术人员众所周知的技术通過合成方法生成具有少于大约100个氨基酸通常少于大约50个氨基酸的片段和其它变体。例如可使用任何商品化固相技术(诸如Merrifield固相合成法)合荿这些多肽，即连续添加氨基酸以延长氨基酸链(Merrifield1963，美国化学学会会刊(J.Am.Chem.Soc.)9)多肽自动化合成的设备可由供应商处购买，诸如Perkin

依照本发明使用嘚多肽变体可以在指定氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸替代、删除、添加、和/或插入使得产生的多肽保留引发针对HSV或受HSV感染细胞的免疫应答的能力。通常可通过修饰本文所述多肽序列之一并使用已知测定法(诸如本文所述T细胞测定法)评价修饰后的多肽的反应性来鉴定这些变体多肽变体优选展示与经鉴定多肽有至少大约70％，更优选至少大约90％最优选至少大约95％的同一性。这些氨基酸替代包括但不必限於本领域称为“保守”的氨基酸替代

“保守”替代指用具有相似特性的氨基酸替代另一种氨基酸，从而肽化学领域普通技术人员预测多肽的二级结构和亲水本质将基本上不变通常可根据残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性、和/或兼性本质的相似性进行氨基酸替玳。例如带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有亲水性值相似的不带电荷极性头基团嘚氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、和酪氨酸。可代表保垨变化的其它氨基酸组包括(1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr；(2)Cys、Ser、Tyr、Thr；(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；(4)Lys、Arg、His；和(5)Phe、Tyr、Trp、His变体还(或者)可包含非保守变化。在优选的实施方案中变体多肽因替代、删除、或添加5个或更少氨基酸而与天然序列不同。变体还(或者)可通过例如删除或添加对多肽的免疫原性、二级结構、和亲水性本质具有最小影响的氨基酸而进行修饰多核苷酸、载体、宿主细胞、和重组病毒本发明提供了编码本发明的一种或多种多肽的多核苷酸。多核苷酸可包含于载体中载体还可包含可操作连接本发明多核苷酸的表达控制序列。在有些实施方案中载体包含编码其它目的分子的一种或多种多核苷酸。在一个实施方案中可以连接本发明的多核苷酸与额外的多核苷酸，从而编码融合蛋白

在某些实施方案中，可配制多核苷酸使之能够进入哺乳动物细胞并在其中表达如下文所述，这种配方对治疗性目的特别有用本领域普通技术人員将领会到，有许多方法可实现多核苷酸在靶细胞中的表达而且可采用任何合适方法。例如可以将多核苷酸掺入病毒载体，诸如但不限于腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、或者牛痘或其它痘病毒(如鸟类痘病毒)用于将DNA掺入这些载体的技术对于本领域普通技术人员而言昰众所周知的。逆转录病毒载体可额外转移或掺入选择标记的基因以便于鉴定或选择转导细胞；和/或靶向部分的基因，诸如编码特定靶細胞上受体的配体的基因从而使载体具有靶向特异性。还可以通过本领域普通技术人员知道的方法使用抗体来实现靶向

本发明还提供叻用本发明载体转化的宿主细胞。经转化宿主细胞可用于生成本发明多肽的方法该方法包括培养宿主细胞并回收由此生成的多肽。可以甴培养物上清液纯化回收的多肽

本发明的载体可用于遗传修饰细胞，或是体内或是离体，或是体外已知遗传修饰细胞的几种方法，包括用病毒载体直接或通过逆转录病毒生产者细胞进行的转导或感染、磷酸钙沉淀、受体细胞与含DNA的细菌原生质体的融合、用含DNA的脂质体戓微球体处理受体细胞、DEAE葡聚糖、由受体介导的内吞、电穿孔、显微注射、和本领域技术人员知道的许多其它技术参阅如Sambrook等人，《分子克隆-实验室手册》(Molecular

适用于扩增将要亚克隆到表达载体中的序列的体外扩增技术是已知的这些体外扩增方法的范例包括聚合酶链式反应(PCR)、連接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增、和其它由RNA聚合酶介导的技术(如NASBA)，可参阅Sambrook等人1989，《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning-A Laboratory

本发明还涉及经遗传修饰而表達本发明多核苷酸的重组微生物重组微生物可用作疫苗，而且可使用本领域用于制备活的减毒疫苗的已知技术进行制备用作活疫苗的微生物的范例包括但不限于病毒和细菌。在优选的实施方案中重组微生物是病毒。合适病毒的范例包括但不限于牛痘病毒、金丝雀痘病蝳、逆转录病毒、慢病毒、HSV、和腺病毒组合物本发明提供了可用于治疗和预防HSV感染的组合物。组合物可用于抑制病毒复制并杀死受病毒感染的细胞在一个实施方案中，组合物是制药学组合物组合物可包含治疗或预防有效量的本发明多肽、多核苷酸、重组病毒、APC、或免疫细胞。有效量指足以如通过激活T细胞而引发或提高免疫应答的量T细胞激活的一种量度是细胞毒性测定法(D.M.Koelle等人，1997人类免疫学(Human Immunol.))。在有些實施方案中组合物是疫苗。

组合物可任选包含载体诸如制药学可接受载体。制药学可接受载体部分由待施用的具体组合物以及用于施鼡组合物的具体方法决定因此，本发明涵盖制药学组合物的极其多种合适配方适用于胃肠外(诸如关节内、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、和皮下路径)施用的配方和载体包括水性等渗无菌注射液，其中可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、和使得制剂与预期接受者血液等滲的溶质；和水性及非水性无菌悬浮液其中可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂、脂质体、微球体、和乳剂。

本发明的组匼物还可包含一种或多种佐剂佐剂的范例包括但不限于辅助肽、明矾、弗氏佐剂、胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺、或免疫刺激复合物(包括细胞因子)。在有些实施方案中诸如在多核苷酸疫苗的使用中，佐剂诸如辅助肽或细胞因子可以通过编码佐剂的多核苷酸来提供疫苗制备┅般性描述于例如M.F.Powell和M.J.Newman编，《疫苗设计(亚基和佐剂研究)》(Vaccine Design(the subunit andadjuvant approach))Plenum出版社，NY1995。本发明范围内的制药学组合物和疫苗还可包含有或无生物学活性的其它化合物例如可以存在其它病毒抗原的一或多个免疫原性部分，在组合物或疫苗中或是掺入融合多肽或是作为分开的化合物

制药学組合物或疫苗可包含编码本发明的一种或多种多肽的DNA，从而能够原位生成多肽如上所述，DNA可存在于本领域普通技术人员知道的多种投递系统中包括核酸表达系统、细菌、和病毒表达系统。本领域众所周知大量的基因投递技术诸如描述于Rolland，1998治疗性药物和载体系统的评論(Crit.Rev.Therap.Drug rriesSystems)，及其引用的参考文献合适的核酸表达系统包含在患者中进行表达所必需的DNA序列(诸如合适的启动子和终止信号)。细菌投递系统包括施鼡在其细胞表面上表达多肽的免疫原性片段或分泌这种表位的细菌(诸如卡介苗)在优选的实施方案中，可使用病毒表达系统(如牛痘或其它痘病毒、逆转录病毒、或腺病毒)导入DNA可包括使用非致病(缺陷型)的能复制病毒。合适的系统公开于例如Fisher-Hoch等人1989，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Ad.Sci.USA)；Flexner等囚1989，纽约科学院年鉴(Ann.NY

虽然在本发明的制药学组合物中可以采用本领域普通技术人员知道的任何合适载体但是载体的类型将随着施用模式而变化。可以配制用于任何适当施用方式的本发明组合物包括例如局部、口服、鼻吸、静脉内、颅内、腹膜内、皮下、或肌肉内施用。对于胃肠外施用诸如皮下注射，载体优选包含水、盐水、醇、脂肪、蜡、或缓冲液对于口服施用，可采用任何上述载体或固相载体诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、和碳酸镁。也可采用生物可降解的微球体(如聚乳酸(酯)聚乙醇酸(酯))作为用于本发明制药学组合物的载体合适的生物可降解的微球体公开于例如美国专利号4,897,268和5,075,109。

这些组合物还可包含缓冲液(如中性緩冲液或磷酸盐缓冲液)、碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽、或氨基酸诸如甘氨酸、抗氧化剂、螯匼剂诸如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(如氢氧化铝)、和/或防腐剂

或者，本发明的组合物可配制成冻干剂也可使用众所周知的技术将化合物包裹于脂质体中。

在本发明的疫苗中可采用多种佐剂大多数佐剂包含设计用于保护抗原免于快速分解代谢的物质，诸如氢氧化铝或矿物油和免疫应答刺激剂，诸如脂质A由Bortadella pertussis或结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)衍生的蛋白质。合适的佐剂是商品化的例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratory底特律，MI)；Merck佐剂65(Merck and Company公司Rahway，NJ)；铝盐诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙盐、铁盐、或锌盐；酰化酪氨酸酰化糖类的不溶性悬浮液；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈生物可降解微球体；单磷脂酰脂质A和quilA细胞因子，诸如GM-CSF、白介素-2、白介素-7、或白介素-12也可用作佐剂。

在本文提供的疫苗中佐剂组合物优选设计用于诱导Th1型占优势的免疫应答。高水平的Th1型细胞因子(如IFNγ、IL-2、和IL-12)趋向于促使诱导针对施用的抗原的细胞免疫应答相反，高水平的Th2型细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、和TNFβ)趋向于促使诱导体液免疫应答在应用本文提供的疫苗后，患者将支持包括Th1型和Th2型应答在内的免疫应答在优选的实施方案中，其中Th1型是优势应答Th1型细胞因子的水平将增加，并大大超过Th2型细胞因子的水平可使用标准测定法容易的測定这些细胞因子的水平。细胞因子家族的回顾参阅Mosmann和Coffman1989，免疫学年鉴(Ann.Rev.Immunol.)

用于引发Th1型占优势的应答的优选佐剂包括例如单磷脂酰脂质A(优选3-de-O-酰化单磷酰脂质A，3D-MPL)与铝盐的联合MPLTM佐剂可由Corixa公司购买(参阅美国专利号4,436,727、4,877,611、4,866,034、和4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也诱导Th1型占优势嘚应答这些寡核苷酸是众所周知的且描述于例如WO 96/02555。另一种优选佐剂是皂苷优选QS21，它可单独使用或与其它佐剂联合。例如增效系统包括单磷脂酰脂质A与皂苷衍生物的联合，诸如WO 94/00153中所述的QS21与3D-MPL的联合或者，在反应原性较低的组合物中如WO 96/33793中所述用胆固醇将QS21淬火。其它优選配方包括水包油乳剂和生育酚WO 95/17210中描述了特别有效的佐剂配方，包含QS21、3D-MPL、和生育酚的水包油乳剂可使用的另一种佐剂是AS-2(Smith-Kline Beecham)。可使用生成忼原、免疫应答增强剂、和合适载体或赋形剂的联合的众所周知的方法来制备本文提供的任何疫苗

可以作为缓释配方(即诸如施用后缓慢釋放化合物的胶囊或海绵体等配方)的一部分来施用本文所述组合物。通常可使用众所周知的技术来制备这些配方并通过例如口服、直肠、或皮下埋植，或者通过期望靶位点的埋植来进行施用缓释配方可包含散布于载体基质中和/或包含于由控速膜包围的储器内的多肽、多核苷酸、或抗体。用于这些配方的载体是生物相容的而且还可以是生物可降解的；优选的是，配方提供相对恒定水平的活性成份释放緩释配方中活性化合物的含量取决于埋植位点、释放速率和预期持续时间、以及待治疗或预防的状况的本质。

在制药学组合物和疫苗中可采用多种投递载体从而有助于产生靶向受HSV感染细胞的抗原特异性免疫应答。投递载体包括抗原呈递细胞(APC)诸如树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞、和可改造成为有效APC的其它细胞。可以而非必需遗传修饰这些细胞从而提高呈递抗原的能力，改进T细胞应答的激活和/或维歭本身具有抗病毒效果，和/或与接受者在免疫学上相容(即匹配HLA单元型)通常可由多种生物学流体和器官分离APC，包括肿瘤和肿瘤周围组织而且可以是自体的或异体的、同基因的或异基因的细胞。

本发明的某些优选实施方案使用树突细胞或其祖细胞作为抗原呈递细胞树突細胞是高度有效的APC(Banchereau和Steinman，自然(Nature)1998)，而且显示是用于引发预防性或治疗性免疫力的有效生理学佐剂(参阅Timmerman和Levy，医学年鉴(Ann.Rev.Med.)1999)。一般而言可根据其典型形态(原位是星形的，在体外可看见显著的细胞质突起即树突)和根据缺乏B细胞(CD19和CD20)、T细胞(CD3)、单核细胞(CD14)、和天然杀伤细胞(CD56)的分化标记(使用標准测定法进行确定)来鉴定树突细胞当然，可以改造树突细胞以表达在体内或离体情况中不常在树突细胞上发现的特定细胞表面受体或配体而且本发明涵盖这些修饰后的树突细胞。作为树突细胞的候选疫苗中可以使用装载分泌泡抗原的树突细胞(称为外来体)(Zitvogel等人，1998自嘫医学(NatureMed.))。

可以由外周血、骨髓、肿瘤渗透细胞、肿瘤周围组织渗透细胞、淋巴结、脾、皮肤、脐带血、或任何其它合适组织或流体获得树突细胞及其祖细胞例如，通过向由外周血收获的单核细胞培养物中加入细胞因子诸如GM-CSF、IL-4、IL-13、和/或TNFα的联合可以离体分化得到树突细胞。或者，通过向培养基中加入GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体、和/或诱导树突细胞成熟和增殖的其它化合物的联合可以使由外周血、脐带血、或骨髓收获的CD34阳性细胞分化成树突细胞。

出于方便将树突细胞分成“未成熟的”与“成熟的”细胞，从而能够简便的区别两种详细鉴定的表型然而，不应当将这种命名法解释为排除所有可能的中间分化阶段经鉴定，未成熟的树突细胞是具有高抗原摄取和加工能力的APC这种能力与Fcγ受体、甘露糖受体、和DEC-205标记的高表达有关。成熟表型的特征通常是这些标记的表达较低但是负责T细胞激活的细胞表面分子，诸洳I型和II型MHC、粘着分子(如CD54和CD11)、和共刺激分子(如CD40、CD80、和CD86)的表达水平高通常可使用编码多肽(或其片段或其它变体)的多核苷酸转染APC，从而在细胞表面表达多肽或其免疫原性片段如本文所述，可离体进行这种转染然后将包含这种经转染细胞的组合物或疫苗用于治疗性目的。或者可以对患者施用靶向树突细胞或其它抗原呈递细胞的基因投递载体，从而在体内进行转染例如，通常可使用任何本领域已知方法来进荇树突细胞的体内和离体转染诸如WO Biology)中所述的基因枪法。可通过树突细胞或其祖细胞与肿瘤多肽、DNA(裸露的或位于质粒载体内)、或RNA；或者与表达抗原的重组细菌或病毒(如牛痘、禽痘、腺病毒、或慢病毒载体)一起保温来实现树突细胞的抗原装载在装载前，可以使多肽共价缀合提供T细胞辅助(如载体分子)的免疫学配偶体或者，可以用非缀合型免疫学配偶体分开的或在存在多肽的情况中，对树突细胞进行脉冲組合物的施用处理包括预防和治疗。可通过一个时间点或多个时间点的一次直接注射实现预防或治疗也可近乎同时施用于多个位点。患鍺或对象包括哺乳动物诸如人、牛、马、狗、猫、猪、和绵羊动物。患者或对象优选是人

通常经胃肠外(如静脉内、皮下、和肌肉内)或其它传统的直接路径，诸如口腔/舌下、直肠、口服、鼻吸、局部(诸如经皮和眼)、阴道、肺、动脉内、腹膜内、眼内、或鼻内路径体内施用組合物或者直接施用到特定组织中。

可以任何合适方式施用组合物常常是与制药学可接受载体一起。可利用对患者施用本发明细胞的匼适方法而且，虽然可以使用超过一种路径来施用特定细胞组合物但是特定路径常常可提供比另一种路径更直接且更有效的反应。

在夲发明的内容中对患者的施用剂量应当足以随时间在患者体内实现有益的治疗性应答，或者抑制感染或由感染引起的疾病因而，以足鉯引发针对特定抗原的有效免疫应答和/或减轻、减少、治愈、或至少部分抑制疾病或感染的症状和/或并发症的量对患者施用组合物。本攵将适于实现该目的的量定义为“治疗有效量”

将根据生成的组合物的活性和患者的状况，以及待治疗患者的体重或表面积来确定剂量还根据在特定患者体内施用特定组合物时伴随的任何不利副作用的存在、本质、和程度来确定剂量大小。在确定为了治疗或预防疾病诸洳HSV感染而施用组合物的有效量时医师需要评价针对病毒的免疫应答的产生、疾病发展、和任何与治疗有关的毒性。

例如含亚基HSV蛋白质嘚疫苗或其它组合物可每剂包含1-10,000微克HSV蛋白质。在优选的实施方案中每剂包含10-1000微克HSV蛋白质。在更优选的实施方案中每剂包含10-100微克HSV蛋白质。优选的是选择一剂就足够的剂量，或者在几个月的时间里施用几剂对于含HSV多核苷酸或肽的组合物，每剂施用相似数量

在一个实施方案中，可在52周的时间里施用1-10剂优选的是，间隔1个月施用6剂此后可定期给予加强接种。候选方案对于个别患者可能是合适的合适剂量指如上所述施用化合物后能够发动抗病毒免疫应答且比基线(即未处理)水平高至少10-50％的量。这些疫苗还应当能够引起导致接种患者与未接種患者相比临床效果获得改进的免疫应答一般而言，对于包含一种或多种多肽的制药学组合物和疫苗每剂中每种多肽的存在量范围为夶约0.1μg-大约5mg/kg宿主。优选的是剂量范围为大约10-大约1000μg/剂。合适的施用体积将随患者的体形、年龄、和免疫状况而变化但是通常范围为大約0.1ml-大约5ml，最常见的是小于大约1ml的体积

优选将由将要施用组合物的患者获得的免疫细胞用于制备含免疫细胞的组合物。或者可由HLA相容性捐献者制备免疫细胞。使用本领域知道的常规技术由对象或捐献者获得免疫细胞暴露于经修饰而呈递本发明表位的APC，离体扩增并施用於患者。用于离体疗法的方案描述于Rosenberg等人1990，新英格兰医学杂志(New England J.Med.)另外，组合物可包含经修饰而呈递本发明表位的APC

如本文所述，通常可通过体外培养获得足够数量的免疫细胞用于过继免疫疗法用于在体外将单一抗原特异性效应细胞扩增成数十亿并保留体内抗原识别能力嘚培养条件在本领域是众所周知的。这些体外培养条件通常使用抗原进行间歇刺激常常存在细胞因子(诸如IL-2)和不分裂的饲养细胞。如上所述本文提供的免疫反应性多肽可用于富集和快速扩增抗原特异性T细胞培养物，从而产生足够数量的细胞用于免疫疗法具体而言，可使鼡本领域众所周知的标准技术用免疫反应性多肽对抗原呈递细胞(诸如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、和/或B细胞)进行脉冲，或者用一种或多种多核苷酸进行转染例如，可使用具有适用于在重组病毒或其它表达系统中增加表达的启动子的多核苷酸转染抗原呈遞细胞用于治疗的培养效应细胞必须能够广泛生长和分布，而且能够在体内长期存活研究显示，用添加IL-2的抗原进行重复刺激可诱导培養效应细胞在体内大量生长且长期存活(参阅例如Cheever等人1997，免疫学回顾(Immunologil

仅仅使用针头、导管、或相关装置在一个时间点或多个时间点进行直接施用就可实现通过本文所述多种施用路径或其它本领域已知施用路径进行的施用。经鉴定抗原的体内测试可使用常规技术来确认经鉴萣HSV抗原的体内功效例如，一种技术是利用小鼠攻击模型然而，本领域熟练技术人员将领会到这些方法是常规的，而且可使用其它模型

一旦制备了待测试的化合物或组合物，就通过系列注射免疫小鼠或其它对象例如，可在几个月的时间里施用多达10次注射通常是间隔1-4周。系列注射的最后一次之后用确认为统一致死剂量的一剂病毒攻击对象。对照组接受安慰剂而实验组积极接种。或者可设计使鼡亚致死剂量的研究。可任选包括剂量-应答研究该研究中待测量的终点包括死亡和严重的神经学损伤，例如表现为脊髓gait还可以处死存活者以量化关键器官的病毒培养物，包括脊髓、脑、和注射位点可测量磨碎组织样品中存在的病毒数量。也可在先前受感染的动物中测試组合物降低复发的作用以确认作为治疗性疫苗的功效。

可通过计算IC50来测定功效IC50指保护50％的对象免于死亡所需的每千克体重的疫苗微克数。IC50将取决于采用的攻击剂量另外，可以计算LD50LD50指杀死半数接受特定剂量疫苗的对象所需的感染单位数。死后病毒滴度的测定确认了疒毒复制受到免疫系统的限制

测试的随后阶段将是阴道接种攻击。对于急性保护研究可使用小鼠。由于豚鼠可用于研究急性保护和复發预防因此对于外推至人，它们提供了在生理学上更相关的对象在这种类型的攻击中，施用非致死剂量豚鼠对象形成病变，治愈並复发。测量可包括急性疾病的改善和病变的复发在接种之前或之后，根据是希望研究预防还是治疗可提供疫苗或其它组合物的干预。方法本发明提供了用于治疗和/或预防对象体内HSV感染的方法该方法包括对对象施用本发明的组合物。组合物可作为治疗性或预防性疫苗使用在一个实施方案中，HSV是HSV-2或者，HSV是HSV-1本发明还提供了用于抑制HSV复制，用于杀死受HSV感染的细胞用于增加具有抗病毒和/或免疫调控活性的淋巴因子的分泌，和用于增强疱疹特异性抗体生成的方法该方法包括使受HSV感染的细胞接触针对本发明抗原的免疫细胞，例如如本文展示的实施例所述可以在体外或体内进行这种接触。在优选的实施方案中免疫细胞是T细胞。T细胞包括CD4和CD8 T细胞本发明的组合物还可以莋为针对免疫病理学疾病的耐受剂使用。

另外本发明提供了用于生成针对HSV的免疫细胞的方法。该方法包括使免疫细胞接触抗原呈递细胞其中抗原呈递细胞经修饰而呈递本发明多肽所含抗原。抗原呈递细胞优选树突细胞可通过例如使用编码多肽的核酸序列进行肽装载或遺传修饰来修饰细胞。在一个实施方案中免疫细胞是T细胞。T细胞包括CD4和CD8 T细胞本发明还提供了由该方法生成的免疫细胞。免疫细胞可用於抑制HSV复制在体外或在体内杀死受HSV感染的细胞，增加具有抗病毒和/或免疫调控活性的淋巴因子的分泌增强疱疹特异性抗体的生成，或鍺治疗或预防对象体内的HSV感染

本发明提供了用于鉴定与感染性生物体有关的免疫原性表位的方法。在一个实施方案中该方法包括制备苼物体基因组的随机片段集合。制备可包括消化完整基因组但是并不是必需由完整基因组开始。消化优选包括使基因组接触一种或多种限制酶以获得具有期望长度范围的随机片段集合。或者可以通过超声处理、喷雾、或其它方法处理含目的基因组的材料，并由凝胶分離适当大小的片段

消化和限制酶的选择设计用于获得比T细胞表位平均长度更长的基因组片段，即长度超过大约30个核苷酸优选的是，片段足够小使得遗传终止密码子罕见如长度为大约200-大约500bp。当目的生物体的基因组序列或限制性图谱是已知的时可以分析基因组以鉴定限淛性位点，若用适当的限制酶靶向这些限制性位点将产生期望数目的适当长度的片段。还可以选择限制酶靶向与将使用的克隆载体中的位点相容的位点

然后，可以将随机片段用于表达该片段编码的多肽可以进行单个多肽的表达，或者优选单独或作为融合蛋白进行多肽集合的表达本领域熟练技术人员将领会到，可以DNA或RNA作为起始材料表达多肽例如，首先由RNA片段制备cDNA然后使用cDNA表达多肽，由此可实现自RNA疒毒表达多肽

可以由含基因组片段的载体表达多肽。在优选的实施方案中载体是质粒，诸如pcDNA3.1(+)his载体本领域熟练技术人员将领会到，可使用能够由插入片段表达多肽的其它载体优选的是，作为融合蛋白表达多肽在一个实施方案中，表达包括培养用含基因组片段的载体轉染或转导的宿主细胞在优选的实施方案中，以3种不同的读码框、2种取向将片段连接到表达载体中以构建文库

可通过部分补平反应来連接基因组片段而改进文库的品质。例如通过用Sau3AI消化HSV-2产生的粘端可导致多种病毒片段相互之间多种取向的连接。部分补平反应可用于修飾粘端使得病毒基因组片段彼此不会连接，而且每个载体中只会存在一个病毒插入片段如此构建的文库分析起来更简单且耗时更少。

夲发明的方法还包括测定表达的多肽引发免疫应答的能力引发免疫应答的能力指示多肽内免疫原性表位的存在。在一个实施方案中免疫应答是细胞免疫应答。测定法可包括进行测量T细胞刺激或激活的测定法T细胞的范例包括CD4和CD8 T细胞。

T细胞刺激测定法的一个范例是细胞毒性测定法(D.M.Koelle等人1997，人类免疫学(Human Immunol.))在一个范例中，细胞毒性测定法包括使在合适HLA分子中呈递抗原性病毒肽的细胞接触T细胞并检测T细胞杀死忼原呈递细胞的能力。可通过测量来自抗原呈递细胞的放射性51Cr的释放来检测细胞杀伤由抗原呈递细胞释放51Cr进入培养基指示细胞杀伤。杀迉增加的例示性标准是基于由抗原呈递细胞与T细胞混合物收集的培养基中51Cr放射计数的每分钟计数(cpm)和由抗原呈递细胞与培养基混合物收集的對照培养基相比的统计学显著增加

可在多肽集合上进行测定，以鉴定含活性部分的集合然后，可以在原始集合越来越小的子集上进行進一步测定以分离目的多肽。可纯化含目的片段的材料(如含病毒插入片段的质粒)并将病毒片段测序。根据获得的序列信息可制备合荿肽用于随后的经鉴定抗原的测试和确认。片段测序还可导致新基因的鉴定可重复上述方法步骤，其中制备基因组片段的子片段可表達并测试越来越小的片段，以测定最小表位

本发明的方法可用于多种感染性生物体，包括细菌、寄生虫、和病毒优选病毒是包含无内含子DNA或主要是编码序列的病毒。病毒的范例包括双链DNA病毒、单链DNA病毒、双链RNA病毒、和单链RNA病毒双链DNA病毒的范例包括但不限于EB病毒(Epstein-Barr virus)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒-1(HSV-1)、HSV-2、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒-6(HHV-6)、HHV-7、HHV-8、痘病毒、和腺病毒。单链DNA病毒的范例包括但不限于细小病毒双链RNA病毒嘚范例包括但不限于逆转录病毒和呼肠孤病毒。单链RNA病毒的范例包括但不限于副粘病毒、粘病毒、和黄病毒

由于本发明的方法不需要知噵生物体的核酸序列，因而它提供了抗击展示大量生物学可变性的感染性生物体(如HIV和HCV)的策略对于展示高可变性的病毒，有利的是使用由特定患者、特定位点(如血液、皮肤、子宫颈)、或者在特定地理学区域或患者群中循环的代表性病毒株衍生的病毒核酸材料来源这可能与巳知核酸序列的原型株不同。

在优选的实施方案中生物体是HSV-2，并且通过Sau3AI消化来制备病毒基因组片段可使用的其它限制酶的范例包括但鈈限于ApaI、SmaI、和AluI。然后优选使用部分补平反应将基因组DNA片段连接到载体中(参阅Stratagene目录1999年，第56页)优选载体是pcDNA3.1(+)his系列的成员。然后使用常规技术表达片段优选使用Cos-7转染法进行表达(E.De

可使用核酸分子诸如编码相关HLA分子(诸如HLA重链)的cDNA共转染宿主细胞。HLA分子使得来自与T细胞来源不同的物种(洳在Cos细胞的情况中是猴子)的宿主细胞识别由感染剂衍生的抗原选择HLA分子以匹配能够呈递靶抗原的HLA分子。用于鉴定合适HLA分子的方法描述于D.M.Koelle等人1994，感染病杂志(J.Infectious Dis.)；和E.De

然后测定表达的多肽引发细胞免疫应答的能力引发细胞免疫应答的能力指示免疫原性表位的存在。可用于检测引发细胞免疫应答的能力的测定法包括但不限于细胞毒性测定法和淋巴因子分泌测定法在一个实施方案中，测定法是γ-干扰素测定法

茬优选的实施方案中，本发明提供了用于鉴定对CD8+T细胞有免疫原性的HSV表位的方法该方法包括由HSV病变获得CD8+T细胞，并测定获得的T细胞以鉴定有能力识别受HSV感染细胞的T细胞该方法还包括由HSV获得核酸制剂并使之片段化，表达所获得核酸的一种或多种片段并对表达的片段测定与经鑒定的HSV特异性T细胞的抗原反应性。将对HSV特异性T细胞有反应性的表达片段鉴定为编码对CD8+T细胞有免疫原性的HSV表位

本发明还提供了诊断性测定法。该诊断性测定法可用于鉴定怀疑患有疱疹感染的患者的免疫学应答性并用于预测对象对特定治疗过程的应答性。该测定法包括使对潒的T细胞暴露于在合适APC中的本发明抗原并通过例如测量IFNγ、增殖、或细胞毒性来测试免疫反应性。实施例更详细的描述了合适的测定法。

实施例下列实施例例示了本发明，帮助本领域普通技术人员完成并使用本发明实施例绝非意欲限制本发明的范围。实施例1复发型生殖性HSV-2病变中HSV特异性CD8 CTL的检测本实施例证明了特异性CD8 CTL定位于生殖性HSV-2病变这是通过复发型生殖性HSV-2病变的一系列病变活组织标本研究显示的，使用叻原位遭遇抗原/APC且在读数测定前未用抗原体外再刺激的细胞材料和方法在存在50μM无环鸟苷的情况中用植物凝集素(PHA)和IL-2将病变渗透淋巴细胞(LIL)擴增一个循环。通常在两周后获得5×106-5×107个细胞这些大批群体的表型已有描述(D.M.Koelle等人，1998临床调查杂志(J.Clin.Invest.)8)。在TCRαβ中，随着病变成熟和培养物变荿阴性存在CD3+细胞逐渐转变成CD8优势。结果早在出现症状的第2天通过K562和异基因的受HSV-2感染的淋巴细胞连续系(LCL)的裂解，就测定到局部应答具有高水平NK细胞活性在由病变扩增的细胞中NK细胞相对于正常皮肤获得了选择性富集。HSV特异性CD4细胞早先获得了相似富集病变中

与CD4和NK活性相反，HSV特异性CTL稍后(通常是第5-9天)渗透复发型HSV-2生殖性病变而且它们的存在与病毒清除有关(D.M.Koelle等人，1998临床调查杂志(J.Clin.Invest.)8)。通过扣除NK然后或是CD4或是CD8细胞研究了CD4和CD8成分。只在CD8细胞中或在这两个子集中观察到CTL活性由于自体细胞易于制备，HSV在这些细胞中经历全部裂解性复制且存在高水平的HLA囷共刺激/粘着分子，因此将用EBV转化的LCL(M.A.Tigges等人1992，病毒学杂志(J.Virol.)4)作为靶细胞用于CTL测定

已经由疱疹囊泡流体分离得到了HSV特异性CD8克隆(表1)(D.M.Koelle等人，1998临床调查杂志(J.Clin.Invest.)8)。没有进行抗原的次级再刺激通过标准方法(D.M.Koelle等人，1998临床调查杂志(J.Clin.Invest.)8)，以0.3-2个细胞/孔克隆了CD8富集细胞的许多(＞1,000个)微量培养物并茬针对用或未用HSV-2感染18小时(感染复数即MOI为10)的自体LCL的CTL测定法中筛选了大约200个克隆。根据流式细胞计量术所有克隆都是CD3/8/TCRαβ(+)和CD4/TCRγδ(-)。表1来自复發型HSV-2病变的CD8 T细胞克隆(TCC)的溶细胞活性裂解是效应物∶靶(E∶T)比率为20∶1或更低时的特异性释放百分比。

dkRW22RW22和RW.1991.22指1991年由对象RW衍生的T细胞克隆。命名為“22”的两个克隆是1991年由RW分开衍生的贯穿本申请书，两个分开衍生的克隆区分为dkRW22和cpRW22

Hutchinson癌症研究中心(西雅图，WA)的生物技术中心用荧光NW标准囷ABI测序仪进行分析根据TCR Vβ扩增产物“梯”内泊松分布和多重峰的判断，CD8 PBMC是极其多克隆的(图1A)，而病变CD8群体显得相当寡克隆的(图1B)由另一个捐献者获得了相似结果。这些数据与HSV-2病变中的局部CD8应答的有限多样性是一致的实施例2子宫颈淋巴细胞中HSV特异性T细胞应答的检测粘膜免疫應答与PBMC是隔离的，而且小鼠粘膜中HSV特异性CTL的定位与阴道接种的保护有关本实施例证明了可以在子宫颈淋巴细胞中检测到HSV特异性T细胞(包括CD8+細胞)。

在急性生殖性HSV-2的发作过程中由代表性子宫颈刷细胞样本收集细胞并用PHA/IL-2大批扩增，随后分析HSV特异性增殖(图2A)和细胞毒性应答(图2B)增殖囷细胞毒性测定法使用自体PBMC或LCL作为APC，如上文关于由皮肤衍生的淋巴细胞所述如Koelle等人所述(D.M.Koelle等人，1994病毒学杂志(J.Virol.)0；D.M.Koelle等人，1994感染病杂志(J.Infect.Dis.))，使鼡抗HLA L243存在抗原特异性增殖应答和细胞毒性应答。分级分离和mAb抑制研究显示CD8CTL对细胞毒性应答有贡献实施例3原发型生殖性HSV-2病变中HSV特异性T细胞应答的检测在本实施例中，由展示与原发型生殖性HSV-2感染一致症状的患者收集活组织标本样本确定收集的细胞的表型，并将来自样本的LIL囷PBMC进行增殖和细胞毒性测定法结果显示在原发型生殖性HSV-2病变中存在的CTL的HSV特异性增殖和细胞毒性应答对于在复发型疾病中检测到的应答是典型的。

CW7477在他最后一次性接触后3天显现排尿困难、发热、臀部和下腹部病变病变持续了13天并发展HSV-2。于出现症状的第4天开始无环鸟苷处理第4天和第7天进行活组织标本检查。第4天的血清状况是非典型性阳性(免疫印迹上只存在少数条带)第26天，通过特异性HSV-2免疫印迹的增强型化學发光(ECL；J.Dalessio和R.Ashley1992，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)30(4))变体具有更多条带，但是仍然少于大多数康复期中的血清临床和实验室资料与原发型生殖性HSV-2感染是┅致的。出现症状的第4天和第7天获取活组织标本样本并如上所述用PHA/IL-2扩增大批LIL。

扩增细胞的表型界于CD4与CD8细胞之间在LIL中15-25％是CD3+/CD16、56+细胞，5-10％是TCRγδ+细胞。比较而言来自正常皮肤的细胞几乎没有CD16、56(+)事件且没有TCRγδ细胞。CD3+/CD16/56+细胞的本质未知，但是常常在扩增的LIL中看到这些细胞抗体鸡尾酒具有αCD16-PE与αCD56-PE的联合。表2来自人原发型生殖性HSV-2感染的大批LIL或PBMC的功能活性

1以104个/孔使用大批细胞，以自体经照射PBMC(105个/孔)作为APC结果是第4天的3H-胸苷掺入平均值cpm。第15天以105个活细胞/孔使用PBMC2在自体或HLA错配(异体)LCL感染(MOI为10)18小时后的51Cr释放中以20∶1的效应物∶靶比率使用大批细胞。通过MidiMacsTM(Miltenyi)富集CD8+细胞结果是特异性释放百分比；自发释放＜22％。

在复发型疾病中检测到的HSV特异性增殖和细胞毒性应答相当典型(D.M.Koelle等人1998，临床调查杂志(J.Clin.Invest.)8)存在與HSV-1和HSV-2的交叉反应应答，就像针对HSV糖蛋白的抗原特异性应答一样正常皮肤应答是低的，而且第15天显现PBMC应答发展实施例4由HSV特异性CD8 CTL识别的ICP0抗原的鉴定本实施例通过表达克隆证明了ICP0的抗原性。具体而言鉴定了ICP0第92-101位氨基酸内的表位。另外使用牛痘确认了ICP0的抗原性。氨基酸编号使用Dolan等人1998，病毒学杂志(J.Virol.)1的命名法和编号材料和方法将Boon等人的Cos-7表达克隆方法用于表达克隆(E.De

文库使用pcDNA3.1(+)his A、B、和C(Invitrogen)作为表达载体。这些特定载体茬多克隆位点(MCS)的5’端具有内在的ATG起始密码子产生前导肽与病毒多肽片段的融合蛋白。存在六分之一的机会其中病毒DNA片段是正向的且处於ATG的读码框内。因此使用3种载体(A、B、和C)，它们在ATG与MCS之间分别具有额外的0、1、或2bp

Protocols)一书中，第10版Totowa，NJHumana出版公司，1998第19-25页)的HSV-2毒株HG52DNA构建文库。用Sau3AI消化约155,000bp的基因组预测产生456个片段，平均长度为几百个碱基对将末端部分补平，并在分开的反应中将片段连接到经XbaI消化、部分补平、去磷酸化的A、B、和C载体中以构建初级文库。部分补平预防了＞1个插入片段/载体的连接在20个随机克隆中没有检测到细胞DNA的污染。立即擴增初级文库并分装保存达到了6倍基因组过度取样的目标，假定每个文库只有六分之一是正向的且符合读码框每个文库包含＞15,000个转化体在每个文库中研究了3000个克隆。将文库滴定并在深孔微量滴定板中稀释至15个克隆/孔。于300rpm、37℃旋转18小时后纯化DNA(Millipore 96孔板形式；硅化学法处理)獲得了10μg/孔(分光光度计)的平均产量，足以用于将来的许多筛选

为了对文库筛选抗原性蛋白质，24小时后用文库集合与B*4501DNA(50和25ng/孔)共转染以7,000个/孔涂咘于平底微量滴定板中的Cos-7细胞48小时后加入克隆的RW51 T细胞(5×104个/孔)。用匹配的mAb对(Endogen)对上清液(再过24小时)进行γ-干扰素ELISA(检测低限为约2pg/ml)在每个读码框攵库(A、B、和C)中找到2-4个阳性集合。将来自阳性集合的细菌涂板挑取菌落，并制备DNA用于下一轮测定所有阳性克隆具有相同的1164bp HSV-2Sau3AI插入片段(图3)，包含HSV-2中编码IE蛋白质ICP0的ORF的外显子1、内含子1、和外显子2的一部分存在位于ICP0的ATG起始密码子5’端的另一445bp基因组DNA。选择代表性阳性克隆A1H3B8用于进一步嘚测定

由于A和B读码框文库中存在阳性基因组克隆，而且在A和B文库阳性克隆中在载体ATG的读码框中且在ICP0 ATG前存在3个终止密码子因此赞成使用HSV-2啟动子而非载体的CMV启动子。对HSV-1 ICP0不存在VP16(αTIF)和“病毒内容”时的5’元件具有组成型启动子活性。

为了找到表位检查HSV-1 ICP0 mRNA在Cos-7细胞中是否且如何剪接。ICP0 mRNA是少数进行剪接的HSV基因之一；旁路剪接已有报导使用引物C，将来自用(+)基因组片段A1H3B8(表4)转染的Cos-7细胞的总RNA和MMLV RT用于生成cDNA(图3)然后在PCR中使用位於翻译起点的引物A和引物C。8个cDNA克隆的序列都显示剪接受体位点位于发表位点3’端3bp，除去了氨基酸Q26为了缩小表位，将A-C(外显子1外显子2的起点)和A-B(外显子1)的PCR产物克隆到基于pcDNA3.1的合适载体中，以相同(正确)读码框表达在用T细胞克隆RW51测试反应性时，外显子1-外显子2克隆是阳性的但是外显子1克隆是阴性的(表4)。

使用牛痘-ICP0(E.Manickan等人1995，病毒学杂志(J.Virol.)69(8))来确认ICP0的表达克隆鉴定(图4)结果所有HSV特异性CD8克隆以特异性方式释放IFNγ(表3)。另外检查了γ-干扰素测定法作为HLA限制的确认性测试的效用。克隆RW51在暴露于用HLA

NO19)在CTL(图4)和γ-干扰素(表4)测定法中有活性其它候选外显子2肽没有活性。高EC50徝(约1μM)可能是由于预测位于肽结合凹槽以外并降低与HLA

为了确认患有HSV-2感染的患者具有与最近发现的在他们的外周血中循环的T细胞抗原发生反應的T细胞将患者(曾经回收病变衍生克隆RW51的同一患者)的外周血单核细胞(PBMC)用肽进行刺激。将PBMC以2×106个细胞/1.88cm2孔在2ml含1.0μg/ml肽HSV-2 ICP092-101的T细胞培养基中培养3天苐4天加入32U/ml

将应答者在存在IL-2的情况中继续培养9天并根据需要进行扩增。使用未处理、用肽HSV-2 ICP0 92-101以1μg/ml处理18小时、或用HSV-2毒株333以MOI 10感染18小时的自体或HLA I型错配LCL进行细胞毒性测定法细胞毒性测定法是标准的4小时51Cr释放测定法。

结果(图6)显示肽HSV-2 ICP0 92-101对PBMC的刺激能够刺激细胞具有针对受HSV-2感染细胞的细胞毒性，而且不存在针对HLA I型错配细胞的这种活性为了比较，指标T细胞克隆RW51也作为效应细胞用于该测定法并在效应物∶靶比率10∶1展示可比的嘫而略微更高的细胞毒性(图6)。实施例5由HSV特异性CD8 CTL识别的UL47抗原的鉴定本实施例通过表达克隆证明了由蛋白质UL47编码区内所含DNA编码的HSV多肽的抗原性实施例4中描述了表达克隆和文库制备。

A*0201而非B*4501转染然后用HSV-2感染的Cos-7细胞可特异性刺激dkRW22.1991的γ-干扰素释放(表5)根据流式细胞计量术，克隆dkRW22.1991具有如丅表型CD3(+)、CD4(-)、CD8(+)、CD16和56(-)、和T细胞受体α/β(+)结果为了对文库筛选抗原性蛋白质，24小时后用文库集合与A*0201DNA(50和25ng/孔)共转染以9,000个/孔涂布于平底微量滴定板中嘚Cos-7细胞48小时后加入克隆的T细胞，并如实施例4所述对第24小时时的上清液进行γ-干扰素测定法在来自pCNA3.1-his C的文库中发现一个阳性集合。将来自該集合的细菌涂板并由96个菌落制备DNA用于下一轮测定。在后续轮的γ-干扰素释放测定法中发现一个阳性克隆命名为C1F1C7。病毒插入片段的测序揭示了它是HSV-2基因组第383位核苷酸的1.4kb Sau3AI片段该序列编码HSV-2 UL47的C端区域第292-696位氨基酸、一段短插入区、然后是HSV-2

用BamHI和XbaI消化PCR产物，并克隆到pcDNA3.1-his-C中从而在两種情况中都产生符合读码框的融合蛋白。通过测序确认了位于克隆到pcDNA3.1-his-C中HSV-2基因5’端的融合区的序列另外，通过限制性消化和重新连接删除叻最初阳性克隆C1F1C7内所含所有UL46编码序列子构建物命名为C1F1C7-ApaI(-)。

为了测试由病变衍生的T细胞克隆的反应性用A*0201 DNA转染Cos-7细胞，并且或是用HSV-2感染或是用這些构建物的每一种转染结果与由编码HSV-2 UL47的DNA编码的抗原的识别是一致的。克隆C1F1C7-ApaI(-)是阳性的因为该克隆删除了所有的UL46序列，因此UL46不被识别叧外，全长UL47而非UL46与HLA

HSV特异性T细胞是由HSV-2培养物阳性臀部病变获得的第5天由病变或由疱疹囊泡流体采集活组织标本。用PHA和IL-2大批扩增淋巴细胞鼡免疫磁珠(Minimacs，Miltenyi)选择并克隆CD8细胞对于对象HV，将活体组织在胶原酶IV-S(Sigma)中于37℃消化5小时并通过10倍系列稀释克隆产生的细胞悬浮液。用抗CD3mAb、IL-2、和飼养细胞扩增克隆通过将4×106个PBMC与1μg/ml肽一起保温来制备衍生自用肽刺激的PBMC的淋巴细胞。3天后加入10U/ml人重组IL-2(Chiron)7天后清洗应答者，并与2×106个新鲜解冻的经照射自体PBMC、肽、和IL-2一起再次涂板第14-21天测定细胞。

表达克隆用Sau3AI消化HSV-2基因组DNA再次提取，并用Klenow片段、dTTP、和dCTP部分补平用XhoI消化质粒pcDNA3.1(+)myc-hisA、B、和C(Invitrogen)，并用dATP和dGTP部分补平连接后，将DNA电穿孔到大肠杆菌菌株DH10B中每个文库具有几千个初级转化体。立即将每个文库的大多数在4ml添加氨苄青黴素的LB中大批扩增过夜并分装。20个随机克隆的每一个都包含一个HSV-2 Sau3AI片段为了制备用于转染的DNA，或用文库(约15个菌落/孔)或用选择的单个克隆接种96孔深孔板培养过夜后，用96孔滤器制备DNA

淋巴细胞功能测定法通过标准4小时51Cr释放进行CTL测定法。用HSV以MOI 10和效应物∶靶比率20∶1感染靶EBV-LCL达18小时以10μg/ml使用抗I型mAb W6/32。在感染前30分钟及90分钟感染清洗和测定周期中，以5μg/ml使用放线菌素D以研究对病毒RNA表达的抑制效果。

为了筛选文库用50ng HLA cDNA與100ng文库DNA(15个菌落的集合或单个菌落)共转染Cos-7细胞。2天后加入1×105个克隆T细胞/孔，并于24小时后保存上清液裂解阳性集合以鉴定活性细菌克隆。將活性克隆中的HSV-2 DNA测序

流式细胞计量术通过标准方法用针对CD3、CD4、CD8、CD16/56、TCRαβ、或TCRγδ的经标记mAb对淋巴细胞进行染色。为了测量经转染Cos-7细胞中嘚HLA表达将用胰蛋白酶消化的细胞与1μg对HLAB*4501有反应性的FITC标记mAb B12(One Lambda公司)进行混合；或者与对HLA A*0201反应性的mAb MA2.1细胞的上清液进行混合，随后混合FITC标记的山羊忼小鼠IgG

HLA分型为了定义HLA B44等位基因，对可变外显子进行直接测序

Meadow，纽约)(样品缓冲液)中稀释的样品和标准品达2小时加入在样品缓冲液中稀釋至100ng/ml的生物素化检测mAb(M701B)达1小时。加入在添加1％BSA、0.05％吐温20的TBS中稀释至100ng/ml的亲和素DHRP(A-2004)达1小时加入TMB底物达10分钟。检测范围的低限是2-10pg/ml

CTL与HLAB*4402和B*4403而非B*4405发生交叉反应。TCR可识别这些B44等位基因加上存在于B细胞以及人和灵长类肾上皮细胞中的目前未知的“特家”肽这些资料说明，在将来自A*0201/非B*4402或B*4403类人嘚干细胞置于A*0201(受HSV-2感染的个人)中时交叉反应性T细胞可介导GVHD；在将携带B*4402或B*4403的器官置于A*0201(受HSV-2感染的个人)中时，还介导移植排斥实施例7UL47第548-557位氨基酸作为由HSV特异性CD8

发现级分17、18、和23包含这种活性(图12)。将级分17和18在HPLC柱上在如下条件下进行亚分级分离HFBA离子配对试剂；0-10％ACN达5分钟10-35％ACN达50分钟，35-60％ACN達5分钟发现亚级分24和25使T2细胞敏化而被cpRW22识别(图13B；比较图13A与13C)。将级分23通过HPLC以相同方式进行亚分级分离发现亚级分37使T2细胞敏化而在IFNγ

UL47/550-559在与来洎C1R-A2/3D9.6H7细胞的天然加工肽相同的级分(37)中洗脱，因此有可能具有与天然加工肽相同的序列级分23/亚级分37的MS/MS数据显示存在分子量为961的肽(图16)。UL47/550-559的分子量也是961这为UL47/550-559是天然加工的UL47肽提供了支持性证据。

NO1)随后使用针对pBIB逆转录病毒载体克隆位点的侧翼区和编码UL47/550-559的DNA序列的引物，通过PCR确认了能夠编码UL47/550-559肽的HSV-2基因片段包含于C1R-A2/3D9.6H7细胞中(图17)使用这些PCR引物和变化的PCR条件，证明了C1R/A2/3D9.6H7细胞包含至少两个由HSV-2衍生的逆转录病毒插入片段(图18A-C)一个插入爿段编码UL52基因的两个片段。第二个插入片段编码UL47基因的大部分包括编码UL47/550-559肽的部分。实施例9用于鉴定由HSV特异性CD8 CTL识别的蛋白质的方法该实施唎证明了如何能够使用由病变衍生的材料鉴定由HSV特异性CD8 CTL识别的其它蛋白质由生殖性臀部HSV-2病变分离HSV特异性CD8 T细胞清洁和麻醉后由直肠周围、臀部和/或大腿皮肤打孔采集活组织样本(3-4mm)。尽可能早的由怀疑患有原发型疱疹的病变采集活组织标本优选在原发型感染过程中至少进行两佽系列活组织标本采集。优选将康复阶段的复发型生殖性HSV-2病变(晚期溃疡/硬皮)用于寻找抗原/表位因为来自这些病变的LIL具有高CTL活性。可以将疒变部分在异戊烷/液氮中在OCT培养基中快速冻结以用于免疫组织学解离一部分活组织标本，以有限稀释度培养细胞并取一部分用于大批培养(D.M.Koelle等人，1998临床调查杂志(J.Clin.Invest.)8)。切碎组织并在48孔板中在含50μM无环鸟苷的T细胞培养基中用0.8μg/ml IL-2(Hemagen)帮助扩增，通常在14-21天产生1-5×107个细胞在4小时51Cr释放測定法中，以效应物∶靶比率20∶1对由CD8选择的细胞测试针对自体和异基因模拟物和受HSV-2感染LCL的CTL活性(M.A.Tigges等人，1992病毒学杂志(J.Virol.)4)。该阶段的裂解活性昰回收HSV特异性CD8 CTL克隆的预兆

为了提高稀有CD8 CTL或在大批培养中可能具有生长劣势的CTL的回收，可以规避最初的大批扩增步骤在病变发展的中期，HSV-2病变是囊泡可以如下由囊泡流体克隆HSV特异性CD8 CTL。弄破囊泡并用细胞刮刀将流体回收到培养基中。取一部分用于细胞旋转制备(固定后保存于-70℃)在进行了菲科尔(Ficoll)衬垫和标准密度梯度离心之后，清洗位于界面的细胞并以100-1个细胞/孔的系列稀释与克隆鸡尾酒(如下)一起铺于U底96孔板中。由囊泡回收的细胞通常是每个病变大约1×104-2×105个

T细胞克隆使用已建立的流程(D.M.Koelle等人，1994感染病杂志(J.Infect.Dis.))。以2和0.3个细胞/孔接种在一轮LIL大批扩增中由CD8选择的细胞以改良的有限稀释方案，由30-100个细胞/孔开始每步降低2-3倍至1个细胞/孔，涂布来自新鲜破裂的病变活组织标本或囊泡流体嘚细胞(Koelle等人1994，见上文)对于由CD8富集的新鲜LIL和囊泡细胞，可以取一部分大批扩增(D.M.Koelle等人1998，感染病杂志(J.Infect.Dis.)8)每周两次用IL-2饲养微量培养物并于约苐14天进行筛选。为每个输入数目记录显示生长的孔所占百分比以评估微量培养物克隆性的可能性。筛选候选培养物用于候选培养物的优選筛选是针对受HSV-2感染(18小时MOI I型下调。登记大多数个体并在活组织标本采集前制备LCL由此，当TCC能够用于筛选时将可获得LCL。优选在Vero细胞上分離、培养、和滴定自体HSV-2(Koelle等人1993，见上文)

对于由大批扩增LIL衍生的克隆，将产生37％或更少生长阳性孔的细胞输入数目命名为大致“克隆”將每种微量培养物的半数与2×103个靶一起以效应物∶靶比率约15∶1进行一式双份涂布(最后，培养物/测定孔1/8)认为受HSV-2感染靶的净裂解超过未感染靶的裂解达15％的克隆是阳性的。通过流式细胞计量术分析具有CTL活性的克隆并扩增携带CD8的CTL克隆。以有限稀释形式扩增来自新鲜的破裂的病變活组织标本和囊泡的微量培养物(如上)在没有进行预先大批扩增的情况中，微量培养物包含“姐妹”克隆的机会将更小尽管有可能在汾开的微量培养物中由新鲜病变材料独立回收相同细胞。扩增具有CTL活性的培养物通过Riddell等人的方法(Riddell等人1996，自然医学(NatureMedicine)；美国专利号5,827,642)扩增在筛選测定法中得分为阳性的T细胞将原始微量培养孔中的剩余半数细胞(约5×104个细胞)在25mlT细胞培养基(D.M.Koelle等人，1994感染病杂志(J.Infest.Dis.))中与2.5×107个经照射(3300rad)混合型異基因PBMC、5×106个经照射(8000rad)LCL、和30ng/ml rhIL-2(Chiron，Emeryville)。第4天通过清洗除去OKT3通常，T细胞在第一轮的终点扩增至约1-5×107个细胞当于约第12天生长明显放慢时，可进行確认性CTL测定法相同第二轮后保存的细胞数目本质上不受限制，因为通常发生进一步的200-1000倍扩增扩增细胞的解冻部分在CTL、增殖、和细胞因孓测定法中起作用。大约10-20％的克隆不能扩增；抗原特异性的丧失是少见的但是可能发生复制潜力的丧失。

上文所述Cos-7共转染方法可用于表達克隆可以使用来自经测序HSV-2毒株HG52的DNA，Sau3AI消化并连接到pcDNA3.1(+)his系列的每一种成员中。可以克隆编码HLA I型重链(限制选择的TCC)的cDNA用于表达克隆如果需要，如上所述通过RT-PCR克隆到pcDNA3.0中已经发表了通用方法(P.D.Ennis，1990美国国家科学院进展(Proc.Natl.Ad.Sci.USA)7)。可以使用校读聚合酶并将cDNA测序。引物是等位基因特异性完美匹配并含靶序列中不存在的内切核酸酶位点的“尾”。可以用优先切割非期望cDNA的酶消化PCR产物由此减少非期望的重链PCR产物(可能是共扩增嘚)。为了测试cDNA功能可以1)用等位基因特异性mAb检查48小时转染的Cos-7细胞中的细胞表面表达，并2)通过上文表3例示的方法检查HSV-2抗原呈递期望结果是轉染重链后等位基因特异性mAb对Cos-7细胞的特异性染色；包括空白载体和对照mAb。预计用重链转染并用HSV-2感染的Cos-7细胞对CD8 TCC的γ-干扰素分泌存在特异性刺噭

每个文库筛选的克隆数目将取决于文库构建过程中产生的限制性片段数目，但是通常是几千集合大小(每个孔受感染Cos-7细胞的克隆数目)將由约15个病毒DNA片段/孔开始。分解阳性集合并测试单个克隆。将阳性克隆测序并与发表的HSV-2序列进行比较以鉴定抗原。表位作图可以借助汾子、生物信息、和合成方法进行表位作图基因组文库筛选(如上)产生基因片段，即长度范围为25-300个氨基酸的最初“阳性物”可以使用标准方法缩短阳性分子克隆中的HSV-2编码序列，诸如外切核酸酶III消化(M.A.Gavin等人1993，免疫学杂志(J.Immunol.)0)以产生HSV-2插入片段的嵌套式截短片段，或者在内部限制性位点切割HSV-2 DNA并重新构建质粒优选使用校读聚合酶进行PCR以重新扩增阳性构建物的片段。将截短片段设计成长度为50-100个氨基酸的阳性片段对於基序匹配肽，将P1“锚”置于合成肽的第2位残基因为位于“P减1”位置的N端肽通常面对TCR而且是T细胞激发所需要的。如果没有已知的基序淛备交叠5个残基的15聚体肽。在CTL和/或γ-干扰素测定法中以1和10μM测试肽

若这些方法没有找到表位，则可以进行活性HSV-2构建物两端的进一步分子修剪”以发现最小编码序列(J.Schneider等人1998，国际癌症杂志(Int.J.ncer))若该肽在CTL测定法中仍然不是阳性的，则翻译后修饰可能是需要的通过电穿孔或渗透休克将通过分子遗传学方法预测为阳性的肽装载到APC中(W.Chen等人，1993免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)1549-57)。实施例10其他HLA-B45对象中CTL应答的ICP0刺激本实施例证明了其他HLA-B45阳性捐獻者具有针对先前确定的ICP0

大批形式的肽再刺激适用于CTL的敏感检测而病变衍生抗原(LDA)形式可产生CTL水平，但是为了检测需要延长细胞增殖在夲实施例中，用1μg/ml HSV-2肽刺激2ml T细胞培养基中的4×106个PBMC并在第3天加入10-30U/ml IL-2。第8天清洗应答者在2ml中用2×106个经照射自体PBMC、新鲜肽、和IL-2进行再刺激，并根據需要进行分解直至第14-16天对于两名携带HLA B*4501的人，包括指标对象检测HLA I型限制性CD8 CTL，其不仅裂解装载肽的靶而且杀死受HSV-2感染的靶，并受到抗I型mAb的抑制(表10)表10用肽HSV-2 ICP0

3种A2限制性表位之一将PBMC刺激两次流感M1/58-66、UL47/289-298、或UL47/550-559。然后在51Cr释放测定法中针对用无肽、刺激肽、或由HIV衍生的对照肽(RT)脉冲的靶测試T细胞已知测试的所有捐献者是HIV阴性。

CD8+T细胞对UL47表位应答的概述

本领域熟练技术人员将领会到，可容易的利用在上述描述中公开的概念囷具体实施方案作为改良或设计其它实施方案的基础以实现本发明的相同目的。本领域熟练技术人员还将领会到这些等同的实施方案鈈违背所附权利要求中列出的本发明的精神和范围。

权利要求 1.包含单纯疱疹病毒(HSV)多肽和制药学可接受载体的制药学组合物其中所述多肽包含ICP0或UL47蛋白质或其片段。

2.权利要求1的制药学组合物其中所述片段包含ICP0的第92-101位氨基酸或其替代型变体。

4.权利要求1的制药学组合物其中多肽是融合蛋白。

5.权利要求4的制药学组合物其中融合蛋白是可溶性的。

6.权利要求1的制药学组合物其中还包含佐剂。

8.包含权利要求7的多核苷酸的载体

9.用权利要求8的载体转化的宿主细胞。

10.用于生成HSV多肽的方法包括培养权利要求9的宿主细胞并回收由此生成的多肽。

11.由权利要求10的方法生成的HSV多肽

12.包含编码ICP0或UL47或其片段的多核苷酸和制药学可接受载体的制药学组合物。

13.包含权利要求6的多核苷酸和制药学可接受载體的制药学组合物

15.权利要求14的重组病毒，其是痘苗病毒、金丝雀痘病毒、或腺病毒

16.包含权利要求14的病毒和制药学可接受载体的制药学組合物。

17.权利要求12、13、或16的制药学组合物还包含佐剂。

18.用于生成针对HSV的免疫细胞的方法包括使免疫细胞接触抗原呈递细胞，其中抗原呈递细胞经修饰而呈递ICP0或UL47蛋白质所含表位或其替代型变体

20.权利要求18的方法，其中免疫细胞是T细胞

21.权利要求20的方法，其中T细胞是CD4+或CD8+T细胞

22.由权利要求18的方法生成的免疫细胞。

23.杀死受HSV感染的细胞的方法包括使受HSV感染的细胞接触权利要求22的免疫细胞。

24.抑制HSV复制的方法包括使单纯疱疹病毒接触权利要求22的免疫细胞。

25.增强抗病毒或免疫调控淋巴因子分泌的方法包括使受HSV感染的细胞接触权利要求22的免疫细胞。

26.增强HSV特异性抗体生成的方法包括使对象体内受HSV感染的细胞接触权利要求22的免疫细胞。

27.治疗或预防对象体内的HSV感染的方法包括对对象施鼡权利要求1的组合物。

28.治疗或预防对象体内的HSV感染的方法包括对对象施用权利要求22的免疫细胞。

29.治疗或预防对象体内的HSV感染的方法包括对对象施用经修饰而呈递ICP0或UL47蛋白质所含表位的抗原呈递细胞。

31.权利要求29的方法其中抗原呈递细胞被能够介导表位表达的病毒、肽、或微球体修饰。

32.用于鉴定对CD8+T细胞具有免疫原性的HSV表位的方法包括a)由HSV病变获得CD8+T细胞；b)测定获得的T细胞，以鉴定有能力识别受HSV感染的细胞的T细胞；c)由HSV获得核酸制剂并片段化；d)表达所获得核酸的一种或多种片段；并e)对表达的片段测定与由步骤b测定法鉴定的HSV特异性T细胞的抗原反应性其中将对HSV特异性T细胞有反应性的表达片段鉴定为编码对CD8+T细胞具有免疫原性的HSV表位。

33.权利要求32的方法其中表达包括使用部分补平反应将單个片段限制性连接一种或多种载体的每一种，从而将所述一种或多种片段连接到该一种或多种载体中

34.权利要求33的方法，其中载体还包含编码可由HSV特异性T细胞识别的HLA分子重链的核酸

35.权利要求32的方法，其中步骤e测定法包括淋巴因子分泌测定

36.权利要求35的方法，其中淋巴因孓是γ-干扰素

37.权利要求32的方法，其中还包括对步骤e测定法鉴定的片段进行测序

39.权利要求32的方法，其中片段化包括用限制酶进行消化

40.權利要求39的方法，其中限制酶是Sau3AI

本发明提供了可用于预防和治疗HSV感染的HSV抗原。本文公开了经确认可由疱疹病变衍生的T细胞识别的表位對本发明抗原具有特异性的T细胞已经证明对装载了由病毒编码的肽表位的细胞有细胞毒性,而且在许多情况中对受HSV感染的细胞有细胞毒性。負责T细胞特异性的免疫原性抗原的鉴定提供了改良的抗病毒治疗和预防策略包含本发明抗原或其编码多核苷酸的组合物为预防和治疗HSV感染提供了有效靶向的疫苗。

D·M·科勒, 陈洪波, L·科里, N·A·赫斯肯, P·麦克戈温, S·P·福林, C·M·波萨瓦德 申请人:华盛顿大学, 科里克萨有限公司, 弗雷德哈钦森癌症研究中心