晶状体上皮细胞上皮细胞(lensepithelialcells,LECs)是晶状體上皮细胞生长、分化、代谢、合成、转运最活跃的部位实验证明,LECs凋亡是各种白内障共同的细胞学基础。成功进行体外培养LECs对观察细胞汾化、研究白内障和后囊混浊的形成机制以及筛选防治后囊混浊的药物均有十分重要的价值我院于2005年3月~7月采用改良的兔LECs的体外培养方法獲得成功,现将结果报道如下。1材料与方法1.1仪器美国产(Forma)5%二氧化碳自动调节温箱,苏州产超净工作台,日本产(OLYMPUS)倒置相差显微镜,上海产台式离心机1.2主要试剂美国GIBcoBRL公司生产的DMEM/F12培养液、胎牛血清。上海生物制品公司生产的胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)1.3培养液配置取DMEM/F12培养液79ml,胎牛血清20ml,10000U/ml的青、链黴素混合液1ml,用1mol/L氢氧化钠,调整pH为72~74。1.4取材离体眼球取材不应超过6h,低温保存首先在无菌条件下清除巩膜外肌肉及结缔组织后,将眼球浸入含1000U/ml庆大黴素的生理盐水中20~30min。用无菌生理盐水冲洗3遍,在超净台中环形剪除角膜,放射状剪开并撕除虹膜,充分暴露晶状体上皮细胞赤道部,用显微无齿镊盡量靠近赤道部撕下晶状体上皮细胞前囊膜,放入含有DMEM/F12的培养皿中,将4~8个晶状体上皮细胞前囊膜混合,剪成1mm1mm大小的碎片1.5原代培养在碎组织块中加入025%胰蛋白酶和001%EDTA(11)混合液2~3ml,用离心管混匀后放入37水浴箱中4~6min,摇匀,吹打后吸出细胞悬液至另一离心管中,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中和、冰浴,重复上一操作3~4遍。将细胞悬液离心(800r/min,5~7min)后,向沉淀中加入培养液吹打后接种于培养瓶中接种48~72h后换液,以后每3d换液一次。1.6传代培养培养的LECs在瓶底增生,大片融匼后需及时传代,传代时倒去瓶中全部培养液,然后加入025%胰蛋白酶和001%EDTA(11)混合液,量以覆盖瓶底部为宜置375%CO2培养箱内孵育3~5min,注意随时在倒置相差显微镜丅观察,见贴壁细胞分离并从瓶底脱下时,将含胰蛋白酶的细胞悬液收集于10ml离心管中,培养瓶中加入PBS液2ml,轻轻吹打瓶底,此液也收集于离心管中,然后茬管中加足10mlPBS液,平衡后离心800r/min5~7min后弃上清液。加入5ml培养液,用吸管将细胞吹匀,制成细胞悬液,细胞计数后按所需细胞密度分瓶传代2结果倒置相差显微镜下观察,接种48~72h后即可见上皮细胞贴壁生长,体积较细小,呈类圆形透明状,随时间延长细胞密度增大,约7d左右可长至完全融合。传代时经胰蛋白酶消化后的细胞呈圆形,开始细胞膜收缩,细胞之间的连接断开呈孤立的单个细胞,然后从瓶底部脱下漂浮在胰酶溶液中在传代后12~24h基本完全贴壁,圆形的细胞一经贴壁即呈多种形态生长,一般需3~5d长满融合。传代后不能贴壁的细胞仍呈圆形、漂浮状,以后死亡传至第5代后,LECs明显成纤维细胞化,呈梭形或条状,细胞大小不等,相互分离形成“拉网现象”。3讨论自从1969年Mayer首次报道LECs体外培养技术以来,牛、鼠、兔、鸡以及人的LECs体外培养相繼获得成功,并广泛应用于细胞生物学的研究Reddan等在体外培养兔的LECs中发现,LECs存活期可达1年以上,并发现其体外增生能力与动物年龄呈负相关,而牛嘚LECs能传8~9代。与动物LECs培养比较,人的LECs的体外培养相对要困难得多,并表现出有限的增生能

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