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川乌高压蒸制工艺优选
第 17 卷第 2 期 2011 年 1 月中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol. 17, No. 2 Jan. , 2011川 乌高 压 蒸 制 工 艺优 选邓广海 , 林华( 1. 广州中医药大学 , 广州[ 摘要 ]1 2*. 广东省中医院药学部 , 广州510120)目的 : 优选川乌高压蒸制的工艺参数。方法 : 采用 正交试验法 考察蒸制时 间、 蒸制 压力及处理 方式等因素 , 以双酯型生物碱、 总生物碱的含量及炮制品的外观评分为指标 , 综合优选川乌高压蒸制的最佳工艺。 结果 : 川乌高压蒸 制的最佳工 艺为 : A5 B3 C3 , 即川乌润湿后 , 于 1. 5 kg ? cm- 2 压力下蒸制 150 min。结论 : 该方 法简单、 可行 而且易 于控制 , 可作 为代替 川乌传 统炮制工艺的新方法。 [ 关键词 ] 川乌 ; 双酯型生物碱 ; 总生物碱 ; 高压蒸制 ; 正交设计 ; HPLC R283. 6 [ 文献标识码 ] A [ 文章编号 ] ( 1-04 [ 中图分类号 ]Orthogonal Test for Optimizing Processing Technology under High-Pressure of Radix AconitiDENG Guang-hai , LIN Hua1 2*( 1. Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, C 2. Department of Pharmacy, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510120, China) [ Abstract] Objective: To optimize the best method of processing Radix Aconiti under high-pressure. Meth-od: Orthogonal test was used to study the effect of three factors including processing time, processing pressure and processing mode. The content of di-ester alkaloids and total alkaloids was determined as the investigative index, at the same time, properties of process was evaluated by the grading methods of synthesizing multiple guidelines to optimize the best method of processing Radix Aconiti under high-pressure. Result: The optimized processing technology was A5 B3 C3 , that is, after wetting with waters, processing under high pressure at 1. 5 kg ? cm od instead of traditional processing technology. [ Key words] HPLC 川 乌 为 毛 茛 科 植 物 乌 头 Aconitum carmichaeli Debx. 的 干 燥 母 根 , 具 有 祛 风 除 湿 , 温 经 止 痛 等 功 效[ 1] - 2for 150 min. Conclu-sion: This method was simple, practical and easy to control, can be used for processing Radix Aconiti as a new methRadix A di- processing under high- orthogonal de-为单酯 型 生 物 碱 , 从 而 毒 性 减 小 和煮法[ 1][ 2]。 2005、 2010 年版《 中国药 典 》 制川 乌 项 下 的 炮制 方 法 为 常 压蒸 法 , 该方法耗时耗能 , 且炮制过程中有 效成分 损失严重。 高 压 蒸 制 法 由 于 其 操 作 简 单、 省 时、 可 控 , 且去毒效果好 , 是目前研究的 热点。近年 来川乌 高压炮制文献 报道 较多 , 但是 对其 主 要 影响 因 素缺 乏系统的考察 , 而且评价指标单一 , 试验结果 也不尽 一致。本试验采用 L1 8 ( 6 × 3 ) 正交表对高压 蒸制的 主要影响因素 进行 考察 , 多指 标优 选 川 乌的 最 佳炮 制工艺 , 以期建立一个省时高效的炮制新方法。 ? 21?6, 为临床常用药。川乌主要含有生物碱类 成分 ,以二帖类双酯型 生物 碱含 量最 高 , 该 类 成分 既 是有 效成分 , 又是毒性成分 , 经加工炮制 后该类 成分转化[ 收 稿日期 ] [ 基 金项目 ] [ 第 一作者 ] [ 通 讯作者 ]8) 广东 省科技 厅 ( 00) 邓广 海 , 在读 研究生 , 研 究方 向 : 中药质 量监 控*林 华 , 硕 士 , 主 任 中 药 师 , Tel: , E-mail: lh3. com第 17 卷第 2 期 2011 年 1 月中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol. 17, No. 2 Jan. , 20111 材料 1. 1 仪器 Agilent-1100 高效 液相色 谱仪 ( DAD 检 测器、 自 动 进 样 器、 在 线 脱 气、 四 元 泵) 、 YXQ-LS18S1 不锈钢手提式压力蒸汽灭菌器。 1. 2 试药 乌 头 碱 ( 批 号
) 、 新乌 头碱 ( 批 号 799-9403) 、 次 乌 头 碱 ( 批 号 404) 购买于中国药品 生物 制品 检定 所 , 川 乌 药材 由 广东 康美药业股 份 有 限 公司 提 供 ( 产 地 : 四 川 ) , 经广 州 中医药大学中药鉴定教研室黄海波 副教授 鉴定为毛 茛科植物 乌 头 Aconitum carmichaeli Debx. 的 干 燥 母 根 ; 乙 腈、 四氢呋 2 方法与结果 2. 1 双酯型生物碱的含量测定 色 谱 条 件- 1入异丙醇 -乙酸乙酯 ( 1∶ 1) 混合溶液 50 mL 与 氨试液 3 mL, 摇匀 , 称定质量 , 放置 16 h, 连续 超 声 30 min, 冷却至室 温 , 再 称 定 质 量 , 用 混 合 溶 液 补 足 减 失 质 量 , 摇匀 , 滤过 , 精密移取续滤液 25 mL, 40 ℃以下减 压回收溶剂至干 , 残渣精密加入 0. 05% 盐 酸 -甲醇液 5 mL 溶解 , 摇匀 , 过 0. 45 μ m 滤膜 , 取续滤液 , 即得。 2. 1. 4 标准曲线 的 制备 分 别精 密 吸 取混 合 对照 品溶液 1, 5, 10, 15, 20 μ L, 按 照 2. 1. 1 项 下 色 谱 条 件 , 测定 3 种生 物碱 的峰 面 积。结 果 新 乌头 碱 的标 准曲线为 : Y = 1 588. 4X + 3. 893 8 ( r = 0. 999 9 ) , 线 性范围 : 0. 023 7 ～0. 474 μ 次乌 头 碱 的 标 准 曲 线 为 : Y = 1 641X + 1. 205 7 ( r = 0. 999 9 ) , 线 性 范 围 : 0. 016 1 ～0. 322 μ 乌 头 碱 的 标 准 曲 线 为 : Y = 1 478. 8 X + 1. 994 2 ( r = 0. 999 9 ) , 线 性 范 围 0. 020 4 ～ 0. 408 μ g。 2. 2 总生物碱的含量测定 取川乌炮制 品粉末 ( 50[ 3]均 为 色 谱 纯 ( 美 国 Burdick &Jackson 公司 ) , 其他试剂均为分析纯 , 水为超纯水。2. 1. 1色 谱 柱 Dikma kromasil( 4. 6 mm × 250 mm, 5 μ m) ; 流动相 [ 乙 腈 -四氢 呋 ( 25∶ 15) ] A-[ 0. 1 mol ?L 乙酸铵 ( 1 000 mL 加乙酸 0. 5 mL) ] B, 梯度洗脱 0 ～ 15 min( 16% →19% A) 15 ～ 45 min ( 19% →22% A) 35% A) 柱温 30 ℃ ; 流速 0. 8 mL ? min- 1目 ) 10. 0 g, 精密称定 , 按照 2005 年版《 中国 药典》 一 部制川乌项下含量测定方法进行测定 2. 3 高压蒸制工艺的研究 2. 3. 1 川乌软化方 式 ①润 透法 : 取 大小均匀的生 川乌 , 除去杂质 , 置于密闭容器中 , 喷洒 适量的 清水 , 使药材全部湿 润 , 底部 不 积水 为 度 , 上 盖 湿布 , 每隔 1 h 拌润 1 次 , 闷 润 约 72 h 至 个大 药 材 切开 内 无干 心 , 即得。②润湿 法 : 取 大小 均 匀的 生 川 乌 , 除 去杂 质 , 置于密闭容器 中 , 喷 洒适 量 的清 水 , 使药 材 全部 湿润 , 底部不积水为度 , 上盖湿布 , 闷润 30 min, 使药 材表层充分润湿 , 即得。 2. 3. 2 炮制工艺 的 优选 取 大小 均 匀 的生 川 乌样6。45 ～ 60 min ( 22% → 。见图 1 。65 ～ 75 min ( 35% A) ; 检验波长 235品 18 份 , 每份 500 g, 按照 L1 8 ( 6 × 3 ) 正 交表 ( 表 1) 的顺序进行炮 制 , 取出 , 切厚片 ( 2 ～ 4 mm) , 50 ℃恒 温干燥 , 即得。表1 图 1 川 乌高 压蒸制 品含 量测定 HPLC 水平 1 2 3 4 5 6 A 蒸制时 间 / min 30 60 90 120 150 180 L18 ( 6 ×36 ) 正 交试验 B 蒸制 压力 / kg ?cm - 2 0. 7 1. 0 1. 5 C 处理方 式 润透 蒸后切 片 润透 切片再 蒸 润湿 蒸后切 片A. 混合 对照品 ; B. 高 压蒸制 品 ; 1. 新 乌头碱 ; 2. 次乌头 碱 ; 3. 乌 头碱2. 1. 2 对照品溶 液 制备分 别精 密 称 取新 乌 头碱2. 37 mg, 乌 头 碱 2. 04 mg, 次 乌 头 碱 1. 61 mg 置 于 10 mL量 瓶 中 , 加 入 0. 05% 盐 酸 -甲 醇 液 , 稀 释 至 刻 度 , 摇匀 , 然后精 密移 取 该 溶 液 1. 0 mL 置 于 10 mL 量瓶中 , 用 0. 05% 盐酸 -甲醇液稀释至刻 度 , 摇 匀 , 制 成每 1 mL 含新乌头碱 23. 7 μ g, 乌头 碱 20. 4 μ g, 次 乌头碱 16. 1 μ g 的混合溶液 , 即得。 2. 1. 3 ? 22? 供试品 溶液制 备 取川 乌炮制 品粉末 ( 50 目 ) 2. 0 g, 精 密 称 定 , 置 具 塞 锥 形 瓶 中 , 精 密 加2. 3. 3 综合评分 值 的确 定本试 验 对 各指 标 进行“ 隶属度” 的计 算 , 对 于 欲达 到 最 大 值的 指 标 ( 如 总 生物碱含量 和 外 观评 分 ) 其 指标 隶 属 度 = ( 指标 值邓广海 , 等 : 川乌高压蒸制工艺优选- 指标最小值 ) / ( 指标最大 值 - 指标 最小 值 ) ; 对于 要进行最小化的指标 ( 如双 酯型生 物碱 含量 ) , 其指 标隶属度 = ( 指 标最 大 值 - 指 标 值 ) / ( 指 标 最 大值 - 指标最小 值 ) 。可 见 , 指 标 最 大 值的 隶 属 度 为 1, 而最小值隶属度为 0, 所 以 0 ≤ 指 标 隶属 度 ≤ 1。首 先要确保川乌的 安全 性 , 就要 降低 双 酯 型生 物 碱的 含量 , 为了保证其有效性 , 要防止总 生物碱 的含量的 流失 , 同时考虑到饮片外观性状 , 因 此试验 设计其炮 制品的权重 为 : 总 双 酯 型 生物 碱 占 50% , 总 生 物 碱 占 35% , 外观评分占 15% 。综合评分 = 总双酯型生 物碱含量的隶属度 × 50% + 总生物 碱含量 的隶属度 × 35% + 炮制 品外 观 评分 的 隶 属度 × 15% , 满 分为 1. 00。外观评分标准见 表 2。 正交 试 验综 合评 分结表 3 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 K1 K2 K3 K4 K5 K6 R A 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 B 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 C 1 2 3 1 2 3 2 3 1 3 1 2 2 3 1 3 1 2 空列 1 2 3 2 3 1 1 2 3 3 1 2 3 1 2 2 3 1 空列 1 2 3 2 3 1 3 1 2 2 3 1 1 2 3 3 1 2果见表 3。表2 药材 炮制品 的外 观评分 评分 项目 5 色泽 乌黑发 亮 3 黑褐 色 2 皮 部黄 褐色 , 木质部 黄白 色 质地 实、 质地 质地 实、 酥脆 断面光 泽 气味 气微 , 无麻舌 感 较 为酥脆 断面 较为光 泽 气微 , 微有麻 舌感 质 较坚实 , 略呈 粉性 断面略 有光 泽 气微 , 有麻 舌感 1 黄白 色质 硬呈 粉性 断面 粗糙 气微 , 麻 舌感 强烈正 交试 验法优 选川 乌高压 蒸制 结果 空列 1 2 3 3 1 2 2 3 1 2 3 1 3 1 2 2 3 1 空列 1 2 3 3 1 2 3 1 2 1 2 3 2 3 1 2 3 1 0.
y3 y1 + y2 + y3 0. 234 9 0. 127 4 0. 110 3 0. 113 6 0. 073 2 0. 093 1 0. 087 6 0. 086 4 0. 052 1 0. 093 8 0. 075 8 0. 047 9 0. 023 8 0. 54 0. 038 5 0. 056 6 0. 016 1 y4 7. 178 8 6. 492 6 7. 846 7 7. 118 5 6. 533 4 7. 923 7 6. 741 1 7. 427 8 7. 4 2 7. 246 7 6. 391 8 6. 685 2 7. 818 4 6. 926 6 7. 234 8 6. 917 7 6. 115 7 y5 7 7 6 9 9 6 9 6 9 6 9 12 15 6 9 8 9 15 综合评 分 0. 222 5 0. 335 2 0. 619 8 0. 521 2 0. 500 2 0. 674 0 0. 507 6 0. 593 2 0. 657 9 0. 620 1 0. 632 5 0. 580 7 0. 742 4 0. 694 6 0. 639 8 0. 698 6 0. 612 5 0. 649 90. 013 2 0. 205 4 0. 016 4 0. 017 4 0. 110 0 0. 056 1 0. 054 2 0. 014 4 0. 099 3 0. 016 8 0. 056 5 0. 060 2 0. 032 9 0. 025 4 0. 062 2 0. 043 2 0. 043 2 0. 027 3 0. 024 8 0. 054 4 0. 039 4 0. 023 3 0. 021 8 0. 023 8 0. 61 -0. 038 8 0. 036 3 0. 015 7 0. 029 8 0. 038 5 -0. 025 1 0. 031 5 0. 016 1 -0. 392 5 0. 552 1 0. 547 7 0. 563 5 0. 570 9 0. 559 1∑ X1 = 10. 502 7 CT = ( ∑ X1 ) 2 / n = 6. 12820. 565 1 0. 561 4 0. 552 7 0. 561 5 0. 579 8 0. 564 9 0. 623 4 0. 586 2 0. 637 0 0. 650 1 0. 625 5 0. 599 8 0. 626 5 0. 589 4 0. 611 1 0. 692 3 0. 653 7 0. 299 8 0. 085 0 0. 102 3 0. 064 0 0. 028 9 0. 067 4 0. 085 8注 : y1 , y2 , y3 分 别表 示新乌 头碱 、 次 乌头碱 , 乌 头碱 的质量 分数 ( mg ?g - 1 ) , y4 为 总生 物碱的 质量 分数 ( mg ?g - 1 ) , y5 为 药材 炮 制品 的 外观 评 分。表 5 同。? 23?第 17 卷第 2 期 2011 年 1 月中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical FormulaeVol. 17, No. 2 Jan. , 20112. 4试验结果分析表4将正 交 试验 结 果 进行 方 差分高压蒸制法是 川 乌 新型 的 炮制 工 艺 , 文 献报 道 炮制工艺不尽一致 , 仅高压蒸制时间就 相差较大 , 为 了充分验证炮 制时 间对 川 乌炮 制品 的 影响 , 本试 验析。结果见表 4 。综合 评分 方差分 析结果 f 5 2 2 8 MS 0. 032 6 0. 013 1 0. 020 0 0. 007 2 F 4. 527 8 1. 819 4 2. 777 8 P & 0. 05 来源 A B C 误差 E SS 0. 163 0 0. 026 1 0. 040 0 0. 057 7设计了 6 个水平 , 结果表 明 , 经高 压蒸制 30 min 后 , 双酯型生物碱明显降低 , 并且随着时间 延长 , 含量逐 渐降低 , 炮制 180 min 后 , 其含 量 几乎 检 测 不 到 , 但 是随着时间延长 , 总生物碱含量也有 所降低。因 此 , 平衡好两者之间的含量是炮制工艺的关键。 川乌传 统炮 制方 法耗时 耗能 , 一 般浸 泡 4 ～ 5 d 至内无干心 , 然后煮 4 ～ 6 h( 或蒸 6 ～ 8 h) 。本 试验 优选出川乌高压蒸制工艺 , 仅需润湿法处理 30 min, 于 1. 5 kg ? cm 压力下蒸制 150 min, 即可 , 大大缩短 了工时 , 并且避免了川乌长时间浸泡导 致发霉 现象 , 去毒效果好 , 总的有效成分含量高 , 是一种较 理想的 炮制方法。实验 验证 结 果也 表 明 , 该 工 艺的 重 复性 较好 , 具有一定的可行性。 文献报道 , 川乌 中 极毒 成 分双 酯 型 生物 碱 在水 和热的作用下 , 水解成苯甲酰单酯型乌 头碱 , 其毒性 仅为双酯型乌头碱 的 1 /50 ～ 1 /500[ 3] - 2注 : F 1 - 0. 05 ( 5, 8) = 3. 69 , F 1 - 0. 05 ( 2, 8) = 4. 46 。由以上方差分析 结 果可 得 出 , 影 响 川乌 高 压蒸 制的因素的主次 顺序 为 : A( 蒸 制时 间 ) & C ( 处 理方 式 ) & B( 蒸制压力 ) , 因素 A( 蒸制时间 ) 中各水平具 有显著性差异。经综合分析确定川 乌炮制 的最佳工 艺 为 A5 B3 C3 , 即 川 乌 经 润 湿 法 处 理 后 , 于 1. 5 kg ? cm 压力下蒸制 150 min, 即得。 2. 5 工艺验证 均匀 称取 川乌 3 份 , 每 份500 g, 用- 2 - 2清水闷润 30 min, 置于手提式压力蒸汽灭菌器 中 , 调 节压力为 1. 5 kg ? cm , 蒸 制 150 min, 取出 , 趁热切 厚片 ( 2 ～ 4 mm) , 放凉 , 于 50 ℃恒 温烘箱 中干燥 , 即 得。含量测定方法同前 , 结果见表 5。表 5 样品 1 2 3 y1 0. 021 9 0. 024 4 0. 020 6 川 乌高压 蒸制 的验证 结果 y2 0. 025 6 0. 025 2 0. 026 0 y1 + y2 0. 047 5 0. 049 6 0. 046 6 y4 7. 726 7 7. 712 5 7. 738 9 y5 0. 754 3 0. 745 3 0. 759 2, 由 此 可见 , 单酯型生物碱的 毒性 已经 大 大的 降低 , 但 仍具 有 一定 的毒性 , 因此笔者 对 验证 试验 样品 中 的 单酯 型 生物 碱也进行了含 量测 定 , 结 果 表明 , 苯甲 酰 乌头 原 碱、 苯甲酰新乌头原碱及苯甲酰次乌头 原碱的含 量总和 为 0. 135 8% , 完 全 符 合 2010 年 版 《 中 国 药 典》 0. 070% ～ 0. 15% 的要求 , 并且双酯 型生 物碱大 大降 低 , 含 量仅 为 0. 004 78% , 总生 物碱 得到 最大 保 留 , 从而达到了“ 减毒增效” 的目的。 [ 参考文献 ][ 1] [ 2] 中国药典. 一部 [ S] . . 龚千锋 . 中药 炮制 学 [ M] . 北 京 : 中 国中 医 药出 版 社 , .注 : 乌 头碱 均未测 出 , 外观 评分均 为 7 。3 讨论 目前川乌软化方 式 主要 为 浸 泡法 , 笔者 前 期试 验结果表明 , 川乌经浸泡处理后 , 毒 性成分 双酯型生 物碱 的 含 量 略 有 降 低 , 而 总 生 物 碱 含 量 流 失 达 36. 92% , 而润透法 处理后川乌总生 物碱含量仅减少 4. 43% , 润湿法处理后川乌总 生物碱含 量基本 不变。 因此 , 本试验选 择润 透法 和润 湿法 作 为 川乌 的 水处 理方法 , 减少川乌有效成分流失。[ 责任编辑仝燕 ]? 24?
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第17卷第3期2011年2月中国实验方剂学杂志ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulaeVol.17，No.32011Feb.，川乌HPLC指纹图谱的研究1*2林华，邓广海（1.广东省中医院药学部，广州.广州中医药大学，广州510405）［NXC18为色谱柱，摘要］目的：建立不同产地川乌药材的高效液相指纹图谱。方法：实验以PhenemonexGemini-流动相0.2%乙酸（浓氨水调pH10.00），?min－1，采用梯度洗脱，流速0.8mL柱温35℃，检验波长235nm，洗脱时间75min。结乙腈-果：建立了川乌药材HPLC指纹图谱共有模式，标定了12个共有峰，鉴别出6个色谱峰的归属，指纹图谱的相似度基本都在92%以上，10批不同产地川乌药材可分为3类。结论：川乌指纹图谱的特征性及专属性强，通过系统聚类分析，可结合含量测定用于全面控制川乌的质量。［关键词］川乌；高效液相色谱法；指纹图谱；聚类分析［中图分类号］R284.1［文献标识码］A［）03-0073-04文章编号］1005-HPLCFingerprintofRadixAconitiLINHua1*，DENGGuang-hai2（1.DepartmentofPharmacy，GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicineGuangdong，Guangzhou510120，China；2.GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510405，China）［Abstract］Objective：ToestablishamethodforHPLC-fingerprintofRadixAconitifromdifferentareas.Method：ThefingerprintforRadixAconitifromdifferentareaswasestablishedbyHPLC.Gemini-NXC18columnwasusedat35℃withacetonitrile-0.2?eticacid（adjustedtopH10.0withammoniawater）asmobilephasebygradienteluting，theflowratewassetat0.8mL?min－1，detectionwavelengthwassetat235nmandelutingpe-riodwas75min.Result：HPLC-fingerprintofR.aconitifromdifferentareaswasestablished，whichcontained12commonpeaks，andsixpeaksinthefingerprintwereidentified，mostofthesimilaritieswereover92%，10batchesofR.aconitifromdifferentareaswereclassifiedintothreegroupsbasedonhierarchicalcluster.Conclusion：Finger-printestablishedwascharacteristicandspecific，combinedwiththedeterminationitcouldbeusedforthequalitycontrolofRadixAconiti.［Keywords］RadixAconiti；HPLC；chromatographicfingerprint；clusteringanalysis川乌为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliDe-bx.的干燥母根［1］，主要分布于四川、陕西、云南、甘肃［2］等省，以四川、陕西的产量最大。川乌主要含有生物碱类成分，以二帖类双酯型生物碱含量较高，该类［3］当容易出现中毒或死亡现象。文献报道表明，不同乌头碱和次乌头碱等双酯产地川乌所含的新乌头碱、，因此，有必要制定一种有效的方法来保证其药材有效性和安全性。本文采型生物碱的含量差异较大用高效液相色谱法建立了川乌药材的指纹图谱，并对其共有峰进行归属鉴别，划分出单酯型和双酯型生物碱的特征区，同时对其指纹图谱进行相似度评价和聚类分析，以期为川乌的质量控制提供一定依据。11.1材料仪器Agilent-1100高效液相色谱仪（DAD检?73?［4］成分毒性强烈，且用药剂量与中毒剂量接近，使用不［收稿日期］1）［基金项目］广东省科技厅资助项目（0）［通讯作者］*林华，主任中药师，硕士，研究方向：中药质量鉴mail：定和品质评价，Tel：，E-.第17卷第3期2011年2月中国实验方剂学杂志ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulaeVol.17，No.32011Feb.，KQ-300VDB测器、自动进样器、在线脱气、四元泵）、A4DL型自动纯水蒸馏器、型数控超声波清洗器、BS210S型电子天平。1.29807）、试药乌头碱（批号0720-新乌头碱（批号799-9403）、200404）次乌头碱（批号110798-等对照品均购买于中国药品生物制品检定所，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等对照品均由上海尚谊化工科技有限公司提供。川乌药材分别采集于四川、陕西、云南等地（表1），经广州中医药大学中药鉴定教研室黄海波副教授鉴定为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliDebx.的干燥母根；乙腈、甲醇均为色谱纯（美国Burdick}Jackson公司），其他试剂均为分析纯，水为超纯水。表1No.S1S2S3S4S5采集地四川（安县）四川（平武）云南（曲靖）贵州四川（江油）10批川乌药材来源No.S6S7S8S9S10采集地河南四川（西昌）四川（永丰）陕西（城固）江西采集时间-009-图1川乌HPLC指纹图谱采集时间-009-A、B.混合对照品；C.生成指纹图谱；9（S）.新乌头碱；10（S）.乌头碱；11（S）.次乌头碱；6.苯甲酰新乌头原碱；S1.苯甲酰乌头原碱；S2.苯甲酰次乌头原碱2.52.5.1方法学考察精密度考察22.1方法与结果NXC18色谱条件色谱柱PhenemonexGemini-（4.6mm×250mm，5μm）；流动相乙腈B-0.2%乙精密吸取同一供试品溶液，按结果12个共有峰的相上述色谱条件重复进样5次，酸（浓氨水调pH10.00）A，梯度洗脱条件0～15min（24%～31%B），15～50min（31%～50%B），50～75min（50%～78%B）；流速0.8mL?min－1；柱温35℃；检验波长235nm。2.2对照品的制备精密称取新乌头碱5.02mg、乌头碱3.95mg及次乌头碱3.04mg置于10mL量瓶中，精密称取苯甲酰新乌头原碱1.02mg、苯甲酰新乌头原碱1.04mg及苯甲酰新乌头原碱1.02mg置于25mL量瓶中，加入0.05%盐酸-甲醇液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。2.3供试品的制备称取川乌粉末（50目）1.0g，精密称定，置于带塞锥形瓶中，加入氨试液1mL，搅拌均匀，润湿30min，加入35mL乙醚，冷浸16h，滤过，滤渣用5mL的乙醚洗涤3次，滤过，合并滤液，低温蒸干，用0.05%盐酸-甲醇液溶解，转移至10mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，即得。2.4测定方法精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按照2.1色谱条对保留时间的RSD均小于0.9%，相对峰面积的RSD均小于2.5%，符合指纹图谱技术要求。2.5.2分别取同一份供试品溶液，按照2.3项下的方法进行提取，采用上述液相色谱条稳定性考察4，8，16，24h进样10μL测定，件，在0，结果12个共相对峰有峰的相对保留时间的RSD均小于0.87%，面积的RSD均小于2.52%，说明供试品溶液在24h内稳定。2.5.3取同一批川乌药材样品5份，按2.3项下供试品溶液制备方法操作，依上述测定重复性考察条件分别进样，结果12个共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.80%，相对峰面积的RSD均小于2.46%，符合指纹图谱技术规定。2.62.6.1川乌指纹图谱的建立共有峰及特征区的标定采用相对保留时间标定共有指纹峰，结果10批川乌标定了12个共有峰，占总峰面积的73.6%。经对照品的HPLC图6，9，10，11号峰分别为鉴定出6个色谱峰，谱定位，苯甲酰新乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱。另外样品S1～S8中含有苯甲酰乌头原碱，样品S2～S8中含有苯甲酰次乌头原碱。根据酯键多少初步件记录75min色谱图，见图1。?74?林华，等：川乌HPLC指纹图谱的研究0～19.862min；Ⅱ区划分为3个区：Ⅰ区（无酯型），（单酯型），19.862～42.678min；Ⅲ区（二酯型以42.678～75min，上），见图2。2.6.2共有峰相对保留时间和相对面积供试品其相对保留色谱图中以11号（次乌头碱）为参照峰，时间和峰面积为1，计算各共有指纹图谱的相对保留时间及峰面积比值。结果9号峰占总峰面积的23.21%，11和6号峰分别占总峰面积的19.18%和14.76%，其他单峰面积均小于10%。结果见表2，3。2.6.3采用国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度软件（2004A指纹图谱相似度评价图210批不同产地川乌的HPLC指纹图谱图表2版），对各产地供试品HPLC图进行处理，生产对照指纹图谱，同时计算出10批药材相似度分别为：0.538，0.970，0.956，0.962，0.961，0.955，0.865，峰5峰60.50.50.50.314峰70.70.70.70.537峰80.40.00.00.569峰90.60.60.60.675峰100.20.20.20.852峰111.01.01.01.000峰121.91.91.91.129不同产地川乌指纹图谱共有峰相对保留时间供试品S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10峰10.80.80.80.048峰20.40.40.40.064峰30.10.10.20.072峰40.10.10.10.091表30.60.50.60.256不同产地川乌指纹图谱共有峰相对峰面积峰50.70.80.00.022峰63.10.80.20.703峰72.70.50.80.117峰80.40.20.40.123峰99.40.70.10.203峰102.00.50.50.072峰111.01.01.01.000峰120.40.10.10.159供试品S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10峰11.40.10.90.098峰22.70.50.50.184峰30.50.20.70.039峰40.80.20.20.1330.928，0.953，0.930。结果表明，除了四川（安县）和四川（西昌）2批的相似度分别为53.8%和86.5%外，其他各批供试品的相似度均大于92%。2.6.4指纹图谱的聚类分析将不同产地川乌药材的HPLC指纹图谱的12个共有峰与色谱峰11（次10批样利用欧氏距离平方为样品测度。结果表明，S4，S6，S3，S5聚为一品共可分为3类，其中样品S2，S8，S10，S9，S7聚为一类，S1单独为一类。实验类，结果与相似度的评价相似，除了样品S1（四川安县）外，其他样品间具有较好的相似性。结果见图3。3讨论3.1提取溶剂及方法的考察川乌主要含有生物碱?75?乌头碱）的比值组成10×12阶原始数据为矩阵，运用SPSS15.0软件对其进行分析，采用最短距离法，第17卷第3期2011年2月中国实验方剂学杂志ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulaeVol.17，No.32011Feb.，0.2%乙酸（浓氨水调pH10.0）为流动相。川乌中因此选择梯度洗脱。各成分极性差异较大，3.4检测波长的考察采用二极管阵列检测器于200～400nm下进行波长扫描，结果230～240nm波长下色谱峰信息量丰富，分离度较好，而230nm波240nm波长下色谱峰数长下色谱图基线漂移严重，图310批川乌HPLC指纹图谱聚类分析图类成分，实验比较了乙醚、氯仿、乙酸乙酯-异丙醇（1∶1）、乙醇、酸水等溶剂的提取效果，结果提示，乙醚的提取效果较好，色谱峰的信息量丰富，分离度高；同时对提取方法（冷浸、超声、先冷浸后超声等）也进行了结果表明，超声和冷浸法均没有明显的差别，但考察，冷浸法对样品的影响较小，因此选择冷浸法。3.2色谱柱的考察实验比较了DikmakromasilC18（4.6mm×250mm，5μm）和PhenemonexGeni-235nm波长下出峰数目比较多，目相对减少，同时因此选择235nm为检测可大大减少基线漂移现象，波长。3.5指纹图谱评价本实验对不同产地川乌HPLC指纹图谱进行相似度和主要成分聚类分析，结果表明，除了四川（安县）外，其他各批之间的相似度均较高，说明各产区川乌质量具有一定的稳定性，但是各批共有峰相对峰面积比值表明，不同产地川乌成分的含量差异较大，这可能是受环境因素的影响，有建立川乌的GAP必要对川乌的生长环境进行考察，基地，从源头上保证川乌的质量。［参考文献］［1］中国药典.一部［S］.2010：26.［2］赵国平，.上海：科技出版社，戴慎.中药大词典［M］.［3］龚千峰.中药炮制学［M］.北京：中国中医药出版社，.［4］张聿梅，鲁静，蒋渝，等.川乌和制川乌中单酯及双酯型.药物分析杂志，2005，25生物碱成分的含量测定［J］（7）：807.mi-NXC18（4.6mm×250mm，5μm）等色谱柱，结果PhenemonexGenimi-NXC18色谱柱的柱效较表明，高，对样品的分离度较好，峰形尖锐，因此选择Phen-emonexGenimi-NXC18为色谱柱。3.3流动相的优化实验对甲醇-乙酸铵缓冲溶液、乙腈-磷酸铵缓冲溶液、乙腈-乙酸铵缓冲溶液、0.2%乙酸（三乙胺调pH6.25）等流动相进行乙腈-6.25，8.0，9.0，9.2，考察，同时对缓冲盐的pH（5.3，10.0）也进行比较，结果表明，样品在强碱性（pH10.0）条件下色谱峰峰形对称，分离度高，峰展宽小，水相中的磷酸铵和醋酸铵缓冲盐两者没有明显差异，由于磷酸铵对色谱柱的损害较大，故选择乙腈-［责任编辑顾雪竹］?76?三亿文库包含各类专业文献、应用写作文书、幼儿教育、小学教育、各类资格考试、中学教育、70川乌HPLC指纹图谱的研究_林华等内容。　
　研究 臧琛 中国实验方剂学杂志 2010(14) :82 林...双向发酵对川乌指纹图谱及乌头碱类成分含量的影响 王...HPLC 测定 陈云华 中国中药杂志 2010(19) :2565 ...}