应用PCR法检测生物制品中支原体污染--《华中农业大学》2013年硕士论文
应用PCR法检测生物制品中支原体污染
【摘要】：支原体(Mycoplasma)是一类缺乏细胞壁的最小原核细胞型微生物,它结构简单,大小介于病毒和细菌之间。自1956年第一次检测到细胞培养物中存在支原体污染以来,支原体污染细胞培养物这个世界性问题持续了半个多世纪,兽用活疫苗中存在支原体污染的事例同样屡见不鲜,严重影响了疫苗的纯净性,降低疫苗的质量进而引发支原体感染,给畜牧业及疫苗生产企业带来巨大的经济损失。为了预防及控制支原体污染,减少支原体污染带来的危害,各种检测技术被应用到支原体污染的检测领域中,各国相继建立了支原体的检测方法。我国对支原体污染的研究工作起步较晚,支原体污染的检测技术有待改进。
为了完善生物制品中支原体污染的检测技术,本研究针对口腔支原体(Ora)、精氨酸支原体(Arg)、发酵支原体(Fer)、莱氏无胆甾原体(Ala)、猪鼻支原体(Mho)、猪肺炎支原体(Mhp)、鸡毒支原体(Mg)、牛支原体(Mbo)、衣阿华支原体(Mi)、滑液支原体(Ms)、絮状支原体(Mf)、火鸡支原体(Mm)、鸡支原体(Gal)、鸭支原体(Ma),共计14种污染生物制品的常见支原体设计引物,建立PCR检测方法,并应用此方法对多种生物制品进行检测。主要试验结果如下：
1.生物制品中支原体污染的PCR检测方法的建立
对14种支原体标准株的基因组序列进行分析,自行设计出一对可以检测这14种支原体的通用引物,同时培养这14种支原体,获取DNA模板,进行PCR扩增反应。结果显示14个模板均有目的片段,且片段大小在440bp-467bp之间,以此建立生物制品中支原体污染的PCR检测方法,扩大污染生物制品的支原体检测范围。
2.生物制品中支原体污染的PCR检测方法的敏感性及特异性试验
使用颜色变化单位法(CCU法)检测出8种支原体培养物的浓度后,对已建立的PCR检测方法进行敏感性试验。结果显示,此方法可以检测到8种支原体的最小浓度在1CCU～10CCU之间；在特异性试验中,选取各类细菌及病毒14种作对照,结果14种对照均不发生扩增反应。试验结果说明此PCR检测方法敏感性良好,特异性强。
3.生物制品中支原体污染的PCR检测方法的应用
应用此方法对10种兽用活疫苗中71个批次的样品和11种细胞系的24份传代细胞样品进行支原体污染检测,结果有3份疫苗样品为阳性、6份细胞样品为阳性。在对比其他支原体污染的检测方法中,已建立的PCR检测方法与培养法、DNA荧光染色法的检测结果均相同,但商品化支原体PCR检测试剂盒主要针对污染细胞的5种支原体有扩增反应,其检测结果是2份疫苗样品为阳性、6份细胞样品为阳性,产生漏检现象。试验结果说明此PCR检测方法的检测结果准确性高,避免出现漏检现象,有较好的应用前景。
【学位授予单位】：华中农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：S852.62
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400-819-9993支原体感染引起的传染性尿道炎较难治愈．如图是支原体细胞结构示意图.相关叙述正确的是( ) A.支原体通过有丝分裂而增殖B.细胞膜和核糖体构成支原体的生物膜系统C.在mRNA合成的同时就会有多个核糖体结合到mRNA上D.青霉素能抑制细胞壁的形成.可用于治疗支原体感染引起的疾病 题目和参考答案——精英家教网——
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支原体感染引起的传染性尿道炎较难治愈．如图是支原体细胞结构示意图，相关叙述正确的是（　　）
A、支原体通过有丝分裂而增殖B、细胞膜和核糖体构成支原体的生物膜系统C、在mRNA合成的同时就会有多个核糖体结合到mRNA上D、青霉素能抑制细胞壁的形成，可用于治疗支原体感染引起的疾病
考点：原核细胞和真核细胞的形态和结构的异同
分析：支原体属于原核生物中最小的一种类型，图中指出了细胞膜和拟核这两个细胞结构，由此看出，支原体没有细胞壁．原核细胞的增殖方式为二分裂法；原核细胞的生物膜系统只包含细胞膜，没有其他膜结构．
解：A、有丝分裂是真核细胞增殖的方式，支原体属于原核细胞，原核细胞通过二分裂法进行增殖，故A错误；B、核糖体没有膜结构，不属于生物膜系统，因此细胞膜构成支原体的生物膜系统，故B错误；C、在mRNA合成的同时就会有多个核糖体结合到mRNA上，这样就加快了蛋白质合成的速度，故C正确；D、图中更可以看出，支原体没有细胞壁，因此青霉素对支原体不起作用，故D错误．故选C．
点评：本题通过支原体细胞结构图解考查了原核生物的相关知识，意在考查考生从题目所给的图形中获取有效信息的能力；理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力．
科目：高中生物
下列可以不在人体细胞的细胞器中进行的化学反应是（　　）
A、CO2的生成B、胃蛋白酶的合成C、血红蛋白的合成D、ATP的合成
科目：高中生物
在洋葱根尖分生区细胞处于（　　）
A、分裂间期时，染色体复制导致细胞中染色体数目加倍B、分裂中期时，细胞中染色体数与核DNA数之比为1：2C、分裂后期时，同源染色体的分离、非同源染色体自由组合D、分裂末期时，细胞中央出现赤道板，向四周扩展形成新的细胞壁
科目：高中生物
资料一：“没有买卖，就没有杀害！”野生东北虎保护受到社会广泛关注．在我国，东北虎的致危因素主要是非法猎杀、栖息地的丧失与破坏、猎物的缺少等．（1）图1所示的食物网中共有条食物链，东北虎和狐的关系为．（2）图1东北虎位于食物链的顶端，其领域里必须要有足够多的猎物才能维持其生存和繁衍，因为能量流动具有特点．（3）图2是能量流经东北虎种群的示意图，其中E1表示东北虎的摄入的能量，那么E2、E4依次表示东北虎的，．（4）东北地区保存有大面积森林，改善栖息环境，以提高，野生东北虎种群恢复仍有希望．资料二：池塘养殖普遍存在由于饵料、鱼类排泄物、换水不及时等引起的水体污染现象，研究者设计了一种循环水池塘养殖系统（如图3）．请回答下列问题：（5）与自然池塘相比，人工养殖池塘生态系统恢复力稳定性．（6）人工养殖池塘水体的N、P含量容易升高，会引起水体的富营养化；藻类等浮游生物大量繁殖、加之死亡后被微生物分解，引起水体的溶氧量下降，造成鱼类等死亡，进一步破坏了生态系统稳态，这种调节方式称为．
科目：高中生物
[生物一选修3现代生物科技专题】请回答下列有关胚胎工程和基因工程的问题：（1）将胚胎干细胞置于子宫内发育成一个体，体现了胚胎干细胞具有．将早期胚胎分割、移植可获得多个同卵胚胎，这属于动物的方法．（2）利用造血干细胞可以治疗白血病，造血干细胞移植之前先要进行培养．动物细胞培养一般分为和两个阶段，和植物细胞培养不同的是，培养时除需要适宜的温度、无菌、无毒等环境条件以外，营养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、核苷酸，还要加入；向培养液中通入95%氧气和5%二氧化碳，氧气参与细胞的代谢，二氧化碳可以维持培养基的．（3）目的基因的表达与鉴定是基因工程的重要环节．用法可以在分子水平上检测是否翻译成了相应蛋白质．用实施基因工程的小麦做抗虫或抗病的接种实验，若仍患病，则必须在对进行改造或修饰，重新进行基因工程的操作．
科目：高中生物
如图表示与人体内环境稳态调节有关的部分结构及关系．（“+”表示促进作用，“-”表示抑制作用）．以下描述错误的是（　　）
A、a细胞为下丘脑细胞B、激素A、B、C分别是促甲状腺素释放激素、促甲状腺素、甲状腺素C、①处效应为抑制效应D、正常情况下，当人体进入寒冷环境中，激素C分泌量将上升，导致产热量增加，体内酶的活性上升
科目：高中生物
生命科学常用图示表示微观物质的结构，图1～3分别表示植物细胞中常见的三种有机物，则图1～3可分别表示（　　）
A、多肽、RNA、淀粉B、DNA、RNA、纤维素C、DNA、蛋白质、糖原D、蛋白质、核酸、糖原
科目：高中生物
用10×目镜、40×物镜的显微镜观测口腔上皮细胞，结果如图所示．若改用10×物镜观测，测到的细胞宽度应该是（　　）
A、3格B、6格C、12格D、64格
科目：高中生物
太平洋深处的一座岛屿由海底火山喷发形成．由于植被盛、物种独特，登岛研究的人员逐渐增多．下列叙述不正确的是（　　）
A、该岛屿物种发展到现阶段是初生演替的结果B、研究人员的到来可能会影响该岛屿的群落演替C、调查岛上一种陆生动物的种群密度需要考虑迁入和迁出的影响D、群落演替过程中岛屿上物种多样性增加
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下列单细胞生物，始终不存在核仁和细胞壁结构的是？A.乳酸菌
B.蓝藻C.支原体 D.变形虫 请分别列举它们各有什么，没什么
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A,B,C只有细胞壁，D只有核仁
A：乳酸菌是真核生物，具有核仁,A错B：蓝藻具有细胞壁，B错D：变形虫具有核仁,D错 C是原核生物，不具有核仁，而且没有细胞壁结构，综上选C
变形虫是一种单细胞生物，属原生动物，主要生活在清水池塘，或在水流缓慢藻类较多的浅水中，以至一般泥土也可找到，亦可成寄生虫寄生在其他生物里面。由于变形虫身体仅由一个细胞构成，没有固定的外形，可以任意改变体形，因此得名。
支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体（支原体是原核细胞，原核细胞的细胞器只有核糖体）。
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什么是支原体感染？
　　支原体是细胞外生存的最小微生物，是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状，分枝状等多种态。它不同于细胞，也不同于病毒，种类繁多、分布广泛、造成的危害相当大，涉及人、动物、植物及昆虫等多个领域，给人类健康和科研工作带来不利影响。从人体分离的16种支原体中，5种对人有致病性，即肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体，生殖支原体及发酵支脲解支原体属含脲解支原体等体、脲解支原体及人型支原体等对人有致病性。　　常见病因：肺炎支原体，解脲支原体，人型支原体，生殖支原体，发酵支脲解支原体。　　常见症状：泌尿生殖道感染，呼吸道感染。　　病理和病因：致病支原体中，肺炎支原体起肺炎，人型支原体，解脲支原体和生殖器支原体主要泌尿生殖道感染。　　支原体肺炎又称原发性非典型肺炎，支原体肺炎全年均可发病，以冬季多见，可有小流行，支原体肺炎是学龄前儿童及青年人常见的一种肺炎，支原体肺炎主要通过飞沫传播，潜伏期较长，可达2～3周，支原体肺炎虽然病程较长，肺部病变较重，炎症吸收较慢，但绝大多数预后都是良好的，病原为肺炎支原体，是一种介于细菌和病毒之间的微生物，无细胞壁结构，兼性厌氧，能独立生活的最小微生物。健康人吸入患者咳嗽，打喷嚏时喷出的口，鼻分泌物而感染。病原体通常存在于呼吸道纤毛上皮之间，不侵入肺实质，通过细胞膜上的神经氨酸受体位点，吸附于宿主呼吸道上皮细胞表面，抑制纤毛活动并破坏上皮细胞。合并症亦少，生殖器支原体感染是近年新明确的一种性接触传播疾病，成人主要通过性接触传播，新生儿则由母亲生殖道分娩时感染，成人男性的感染部位在尿道黏膜，女性感染部位在宫颈，新生儿主要引起结膜炎和肺炎。　　临床表现　　1、泌尿生殖道感染　　泌尿生殖道感染：潜伏期为1～3周，典型的急性期症状与其他非淋病性生殖泌尿系统感染相似，表现为尿道刺痛，不同程度的尿急及尿频，排尿刺痛，特别是当尿液较为浓缩的时候明显，尿道口轻度红肿，分泌物稀薄，量少，为浆液性或脓性，多需用力挤压尿道才见分泌物溢出，常于晨起尿道口有少量黏液性分泌物或仅有痂膜封口，或见污秽裤裆，亚急性期常合并前列腺感染，患者常出现会阴部胀痛，腰酸，双股内侧不适感或在做提肛动作时有自会阴向股内侧发散的刺痛感，　　女性患者多见以子宫颈为中心扩散的生殖系炎症，多数无明显自觉症状，少数重症病人有阴道坠感，当感染扩及尿道时，尿频，尿急是引起病人注意的主要症状，感染局限在子宫颈，表现为白带增多，混浊，子宫颈水肿，充血或表面糜烂，感染扩及尿道表现为尿道口潮红，充血，挤压尿道可有少量分泌物外溢，但很少有压痛出现。　　即使怀孕也很容易导致胚胎夭折、胎儿死亡、自然流产、低体重儿等。女性感染人型支原体，还可以引起肾盂肾炎、盆腔炎流产后发热，产后发热、非淋球菌尿道炎等疾病。　　2、呼吸道感染　　起病缓慢，潜伏期2～3周，病初有全身不适，乏力、头痛。2～3天后出现发热体温常达39℃左右，可持续1～3周，可伴有咽痛和肌肉酸痛。　　检查　　1、血常规　　周围血白细胞总数正常或稍增多，以中性粒细胞为主。　　2、X线检查　　支原体肺炎胸片无特异性，多为单侧下叶浸润，表现为节段性肺炎，严重者呈广泛双侧肺炎。　　3、病原学检查　　痰、鼻和喉拭子培养查肺炎支原体。　　4、血清学检查　　血清病原抗体效价&1：32、链球菌MG凝集试验，效价≥1：40为阳性，连续两次4倍以上增高有诊断价值。　　起病后2周，约2/3病人冷凝集试验阳性，滴定效价大于1：32，特别是当滴度逐步升高时，有诊断价值。约半数病人对链球菌MG凝集试验阳性。诊断的进一步证实有赖于血清中支原体IgM抗体的测定（酶联免疫吸附试验最敏感，免疫荧光法特异性强，间接血凝法较实用）。抗原检测可用PCR法，但试剂药盒还有待改进，以提高敏感性和特异性。　　5、PCR技术　　普通PCR技术检测肺炎衣原体特异性DNA，具有快速、简便、特异的优点，敏感性高于细胞分离技术，用套式PCR（nPCR）检测可显著提高其敏感性。　　治疗　　早期使用适当抗菌药物可减轻症状及缩短病程。本病有自限性，多数病例不经治疗可自愈。大环内酯类抗菌药物为首选，如红霉素、罗红霉素和阿奇霉素。氟喹诺酮类如左氧氟沙星、加替沙星和莫西沙星等，四环素类也用于肺炎支原体肺炎的治疗。疗程一般2～3周。因肺炎支原体无细胞壁，青霉素或头孢菌素类等抗菌药物无效。对剧烈呛咳者，应适当给予镇咳药。若继发细菌感染，可根据痰病原学检查，选用针对性的抗菌药物治疗。　　本病具有自限性，多数病例不经治疗可自愈，使用适当的抗菌药物可以减轻症状，缩短病程。治疗首选红霉素，亦可用四环族抗生素。早期使用适当的抗生素可以减轻症状，缩短病程至7～10天。
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