也是每个实验者必须养成的良好的工作习惯
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目&&&&实验室守则实验记录及实验报告&&&&录&&&&第一部分：生物分子基础生物化学实验实验一实验二实验三实验四实验五实验六实验七实验八实验九实验十淀粉的提取…………………………………………………6还原糖的滴定分析…………………………………………8酶的基本性质考察：影响酶活性的因素…………………11底物浓度对酶活力的影响（米氏常数的测定）…………15纸层析法分离鉴定氨基酸…………………………………18蛋白质的定量分析：双缩脲法测定血清总蛋白…………22核酸的定量测定…………………………………………37&&&&维生素C的定量测定………………………………………41酪蛋白的制备………………………………………………47高铁—硫酸显色法测定血清总胆固醇……………………48第二部分：系统性实验&&&&实验十一血红蛋白的提取和分离……………………………………50实验十二凝胶过滤层析纯化血红蛋白………………………………52实验十三聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血红蛋白………………58实验十四血红蛋白与高铁血红蛋白分子吸收光谱的绘制与比较…66实验十五SDS标准工作曲线法定量测定血红蛋白………………68脱辅基血红蛋白的制备和重组…………………………70&&&&实验十六&&&&附录………………………………………………………………………73&&&&1&&&&&&&&实验室守则&&&&一、遵守纪律，认真实验&&&&每个学员应该自觉地遵守课堂纪律，维护课堂秩序，保持室内安静，不大声谈笑。实验过程中要听从教师指导，严格认真地按操作规程进行实验。并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上，完成实验后经教师检查同意，方可离开实验室、实验后要认真写好实验报告，由课代表按期收交给教师，不得无故拖延。&&&&二、保持整洁&&&&保持环境和仪器的整齐清洁是做好实验的重要条件，也是每个实验者必须养成的良好的工作习惯。实验台面和试剂药品架上都必须保持整洁，仪器药品放置要有次序，不要把试剂、药品洒在实验台面和地上，废液应倒进水槽内（强酸强碱必须都应倒入废品缸内，不可倒入水槽或随便丢弃。实验完毕需将仪器洗净收好，药品试排列整齐。把实验台面抹擦干净，保持实验室整齐清洁。）&&&&三、药品使用&&&&1、使用药品试剂必须注意节约杜绝浪费，要特别注意保持药品和试剂的纯净，药品用后须立即将瓶盖塞紧放回原处，从瓶中取出的试剂，标准溶液等，如未用尽切勿倒回瓶内，避免混杂与污染2、任何装有化学药品的容器都必须贴上标签，注明其内容及配制时间。3、在使用任何化学药品前，一定要熟知该化学药品之性质。4、在使用任何化学药品时，一定要穿着工作服，必要时应配戴必要的个人防护具，如防护服、防护手套等。使用时务必仔细小心。&&&&四、仪器使用&&&&各种仪器用具均应注意爱护，细心使用，防止损坏，使用分析天平，分光光度计和电动离心机等贵重精密仪器，要严格遵守操作规程，发现故障立即报告教师，不要自己动手检修，要爱护公共财产，厉行节约。&&&&五、注意安全&&&&为了有效地维护实验室安全，保证实验正常进行，要求：1、要严格做到：火着人在，人走火灭。2、勿使乙醚、丙酮、醇类等易燃液体接近火焰，蒸发或加热此类液体时，必须在水浴上进行，切勿用明火直接加热。3、凡比水轻且不与水相混溶之物（如醚、苯、汽油等）着火时，应迅速用湿毛巾覆盖火焰，以隔绝空气使其熄灭，绝不能倒水于其上，以免火焰蔓延，对于易与水混溶之物（如乙&&&&2&&&&&&&&醇、丙酮等）着火时，可用灭火器扑灭之。4、有不少药品是有毒或有腐蚀性的不可用手直接拿药品，不可将试剂瓶直接对准鼻子嗅闻，更不可品尝药品味道。吸取有毒试剂，强酸和强碱时，均应用洗耳球，严禁用口吸取。5、离开实验室时，要关好水龙头，拉下电闸，认真负责地进行检查，严防不安全事故。6、每次实验课由班长安排同学轮流值日，值日生要负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性工作。&&&&六、意外事件处理&&&&（一）发生可控制的火灾时，使用附近的灭火器，应注意灭火器的类型，按以下步骤进行操作：a、揭开环状保险栓。b、挤压杠杆。c、将喷嘴对火苗底部。2、若是衣服着火，可用湿布掩盖，以达到窒息火苗的目的。3、若是电线失火，应立即关闭电源后灭火。4、迅速向实验室负责人报告。（二）当发生无法控制的火灾时：1、立即通知实验室其他人员，撤离人员、重要物资。2、离开实验室时应将所有电源关掉。3、立即拨打火警电话。（三）当发生人身意外伤害时，伤者需要立即送医，并报告实验室安全负责人。&&&&严守规范&&&&整洁有序&&&&3&&&&&&&&实验记录及实验报告&&&&一、实验记录&&&&实验课前应认真预习，将实验名称、目的和要求、原理、实验内容、操作方法和步骤等详细地写在记录本中。实验记录本应标上页数，不要撕去任何一页，不要抹擦及涂改，写错时可以准确地划去重写，记录时必须使用钢笔或圆珠笔。实验中观察到的现象，结果和数据，应该及时地直接记在记录本上，绝对不可以用单片纸做记录或草稿、原始记录必须准确、详尽、清楚，从实验课开始就应养成这种良好、规范的科研习惯。记录时，应做到正确记录实验结果，切忌夹杂主观因素—这一点十分重要。在实验条件下观察到的现象，应如实仔细地记录下来。在定量实验中观测的数据，如称量物的重量，滴定管的读数。光电比色计或分光光度计的读数等，都应设计一定的表格准确记下正确的读数，并根据仪器的精确度准确记录有效数字。例如，光密度值为0.050，不应写成0.05。实验记录上的每一个数字，都是反映每一次的测量结果，所以，重复观测时即使数据完成相同也应如实记录下来。数据的计算也应该写在记录本的另一页上，一般写在正式记录左边的一页。总之，实验的每个结果都应正确无遗漏地做好记录。实验中使用仪器的类型、编号以及试剂的规格、化学式、分子量准确的浓度等，都应记录清楚，以便总结实验进行校对和作为查找成败原因的参考依据。每个仪器使用者在仪器使用结束后都必须对仪器的使用情况与状态进行登记，并签名，如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等，都必须重做实验。因为，将不可靠的结果当做正确的记录，在实际工作中可能造成难以估计的损失，所以，在学习期间就应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。&&&&二、实验报告&&&&实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告，按照实验内容可分为定性和定量实验两大类，下面分别列举这两类实验报告的格式，仅供参考。1、关于定性实验报告实验（编号）（实验名称）（一）目的和要求（二）原理（三）试剂和仪器（四）操作方法&&&&4&&&&&&&&（五）结果与讨论一般每次实验课做数个定性实验，实验报告中的实验名称和目的要求应该是针对这次实验课的全部内容而必须达到的目的和要求。在写实验报告时，可以按照实验内容分别写原理、操作方法、结果与讨论等。原理部分应简述基本原理。操作方法（或步骤）可以采用工艺流程图的方式或自行设计的表格来表示（某些实验的操作方法可以和结果与讨论部分合并，自行设计各种表格综合书写）。结果与讨论包括实验结果及观察现象的小结、对实验课遇到的问题（和思考题）进行探讨以及对实验的改进意见等。&&&&2、关于定量实验报告&&&&实验（编号）（实验名称）（一）目的和要求（二）原理（三）试剂和仪器（四）操作方法（五）结果处理（六）讨论通常每次实验课只做一个定量实验，在实验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述，但是对于实验条件（试剂及仪器）和操作的关键环节必须写清楚，对于实验结果部分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始数据及其处理的表格、标准曲线图（以及比实验组与对照组实验结果的图表）等。（另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析）。讨论部分可以包括：关于实验方法（或操作技术）和有关实验的一些问题，如实验的正常结果和异常现象（以及思考题）进行探讨，对于实验设计的认识、体会和建议，对实验课的改进意见等。&&&&5&&&&&&&&实验一淀粉的提取&&&&一、目的要求&&&&掌握淀粉提取和水解的原理及操作方法。&&&&二、实验原理&&&&多糖是自然界分布最广的糖类，由多个单糖分子缩合而成，具有多种生物学功能，如植物纤维素可构成植物的骨架，而淀粉、糖原则作为营养的存储形式。本实验以地瓜为原料，利用多糖能和水形成胶体溶液的原理，采用过滤、离心等方法提取淀粉。糖苷键对酸和酶敏感，所以淀粉在酸和体内淀粉酶的作用下被降解成单糖，这种降解过程是逐步进行的，降解的中间产物遇碘呈现不同的颜色：淀粉→红色糊精→无色糊精→麦芽糖→葡萄糖（紫蓝色）（红色）（无色）&&&&所以根据水解液和碘反应的颜色，可以判断水解是否已完全。本实验中采用酸水解的方法，用过量的酸保证水解完全。&&&&三、试剂与器材&&&&捣碎机、恒温水浴锅&&&&四、操作方法&&&&（1）淀粉的提取甘薯去皮切成小块（约0.3×0.3×0.3cm3），准确称取15g，加入60mL蒸镏水，放入组织捣碎机中捣碎1min（以上步骤可以4组合作）。匀浆液用四层纱布过滤，滤渣用少量水洗，滤液合并后置50℃恒温水浴中保温30min。轻轻地尽量倾去上层有色溶液，25mL蒸馏水重新悬浮白色沉淀，待重新沉淀后再倾去上层溶液，滤纸过滤或用离心机离心（3000r/m，10min），再用少量水洗沉淀，离心，置烘箱内烘干（105℃烘干4h）后称重。（2）淀粉的水解称取淀粉1.0g，放在大试管中用少量水调成糊状，再加入15mL和6mol/L盐酸10mL，搅拌均匀后放在沸水浴上水解半小时，冷却后用6mol/L氢氧化钠中和至溶液呈中性，然后定容至100mL，再取10mL定容到100mL成为稀释1000倍的总糖水解液。&&&&五、注意事项&&&&（1）淀粉提取时水浴温度不能超过50℃，否则会因溶解度增大而减少产量；（2）倾出上清时要尽可能小心，避免沉降的淀粉被震动起来。（3）离心机使用时注意先进行平衡。&&&&6&&&&&&&&六、思考题&&&&（1）如何选择生化物质提取实验中的实验材料？有何标准？（2）材料的破碎方法有哪些？&&&&7&&&&&&&&实验二还原糖的滴定分析&&&&一、目的要求&&&&掌握碱性铜试剂法测定还原糖的原理和操作方法。&&&&二、实验原理&&&&单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖和蔗糖等属于非还原性糖。利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。还原糖的测定方法多种，本实验采用间接滴定法。其原理是：在碱性溶液中，二价铜离子被还原糖还原成一价的氧化亚铜，氧化亚铜在酸性环境中与一定量的过量碘起反应，再用标准硫代硫酸钠滴定剩余的碘，即可算出还原糖的含量。反应方程式是：&&&&2NaOH+CuSO4=Cu(OH)2&&&&COOKCu(OH)2&&&&+Na2SO4&&&&COOK&&&&+&&&&H&&&&C&&&&OHOH&&&&HC&&&&=&&&&H&&&&C&&&&OO&&&&HC&&&&Cu&&&&+2H2O&&&&COONa&&&&酒石酸钾钠&&&&COONa可溶性的氧化铜络合物可溶性的氧化铜络合物&&&&酒石酸钾钠&&&&COOK2HCOOCHOCu&&&&COOKHCOHOH&&&&COOH&&&&HC&&&&+(CHOH)4+2H2O=2&&&&CH2OH葡萄糖&&&&HC&&&&+(CHOH)4+Cu2O&&&&CH2OH葡萄糖酸&&&&COONa&&&&COONa酒石酸钾钠&&&&IO3-+5I-+6H+Cu2O+I2+H+I2+2S2O32-&&&&3I2+3H2OCu2++I-+H2OS4O62-+I-&&&&8&&&&&&&&三、试剂与器材&&&&1.试剂（1）铜试剂：（A）13g硫酸铜加水至200mL（B）24g酒石酸钾钠、40g无水碳酸钠、50g碳酸氢钠、36g草酸钾、1.6g碘酸钾。制备溶液B时，先用500mL热水溶化前三种试剂，再加后两种至1000mL，最后将（A）、（B）等量混合。（2）0.005mol/L硫代硫酸钠：1.24g硫代硫酸钠和0.1g碳酸钠加水配成1000mL。（3）1%淀粉：1g可溶性淀粉溶于100mL饱和的NaCl溶液中煮沸。（4）2%碘化钾：20gKl用水溶至1000mL。（5）1mol/L硫酸：166.6mL母液溶于水至1500mL。（6）0.5mg/mL标准葡萄糖：0.5g葡萄糖加水至1000mL。2、器材碱式滴定管、恒温水浴锅&&&&四、操作步骤&&&&（1）样品中总糖的水解称取淀粉1.0g，放在大试管中用少量水调成糊状，再加入15mL水和6mol/L盐酸10mL，搅拌均匀后放在沸水浴上水解半小时，冷却后用6mol/L氢氧化钠中和至溶液呈中性，然后定容至100mL，再取10mL定容到100mL成为稀释1000倍的总糖水解液。（2）取6只试管，按照下表的次序加入试剂。另取6个小三角烧瓶，按相应的试管顺序编号。试剂管号空白试验标准试验总糖试验O（mL）标准葡萄糖（mL）还原糖提取液（mL）总糖水解液（mL）铜试剂（mL）444444&&&&沸水浴中煮&&&&15&&&&分钟&&&&（3）各试管冷却后，摇动试管，使试管底部的红色沉淀分散后倾入相应的三角瓶中。（4）分别在每个试管中加入2mL2%碘化钾溶液和2mLmol/LH2SO4，以洗涤管中的残留物，并转入相应的三角瓶中，最后再用蒸馏水洗涤试管2次，每次1mL，洗涤液均转入相同的三角瓶中；（5）用0.005mol/LNaS2O3，滴定至碘颜色接近消失时加入淀粉指示剂5滴，继续滴定至&&&&9&&&&&&&&蓝色消失为止。&&&&五、计算&&&&按照如下公式计算还原糖的含量：&&&&X?&&&&0.5V空?V未知?V空?V标&&&&六、注意事项&&&&（1）各试管的处理应一致，测定溶液应同时放入沸水中，再同时从沸水浴中取出。（2）在用碘化钾和硫酸洗涤试管时要洗净，否则会影响滴定结果的准确性。（3）滴定终点时溶液呈现二价铜离子的浅蓝色，切勿认为终点还未达到。&&&&七、思考题&&&&碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴定还是间接滴定？两种滴定方法各有何优点？&&&&10&&&&&&&&实验三影响酶活性的因素&&&&一、目的要求&&&&观察淀粉在水解过程中遇碘后溶液颜色的变化。观察温度、pH、激活剂与抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响。&&&&二、实验原理&&&&人唾液中淀粉酶为α-淀粉酶，在唾液腺细胞内合成。在唾液淀粉酶的作用下，淀粉发生水解，产生—系列被称为糊精的中间产物，最后生成麦芽糖和葡萄糖。变化过程如下：淀粉→紫色糊精→红色糊精→麦芽糖、葡萄糖淀粉、紫色糊精、红色糊精遇碘后分别呈蓝色、紫色与红色。麦芽糖和葡萄糖遇碘不变色。淀粉与糊精无还原性，或还原性很弱，对本尼迪克特试剂呈阴性反应。麦芽糖、葡萄糖是还原糖，与本尼迪克特试剂共热后生成棕色氧化亚铜的沉淀。唾液淀粉酶的最适温度为37-40℃，最适pH为6.8。偏离此最适环境时，酶的活性减弱。低浓度的氯离子能增加淀粉酶的活性，是它的激活剂。Cu2+等金属离子能降低该酶的活性，是它的抑制剂。&&&&三、器材及试剂&&&&1、器材：试管、烧杯、量筒、恒温水浴锅、试管夹、试管架2、试剂：（1）唾液淀粉酶液：实验者先用蒸馏水嗽口，然后含一口蒸馏水于口中，轻嗽一、二分钟，吐入小烧杯中，用脱脂棉过滤，除去稀释液中可能含有食物的食物残渣。并将该滤液稀释一倍。（2）1%淀粉溶液（含0.3%NaCl）：将1g可溶性淀粉与0.3g氯化钠，混悬于5mL的蒸馏水中，搅动后缓慢倒入沸腾的95mL蒸馏水中，煮沸1分钟，冷却后倒入试剂瓶中。（3）碘液：称取2g碘化钾溶于5mL蒸馏水中。再加1g碘。待碘完全溶解后，加蒸馏水295mL，混合均匀后贮于棕色瓶内。（4）本尼迪克特（Benedict）试剂：将17.3g硫酸铜晶体溶入100mL蒸馏水中，然后加入100mL蒸馏水。取柠檬酸钠173g及碳酸钠100g，加蒸馏水600mL，加热使之溶解。冷却后，再加蒸馏水200mL。最后，把硫酸铜溶液缓慢地倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤除去或自然沉降一段时间取上清液。此试剂可长期保存。&&&&11&&&&&&&&（5）0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（6）0.1mol/L柠檬酸溶液（7）1%NaCl溶液（8）1%CuSO4溶液（9）0.1%淀粉溶液&&&&四、操作步骤&&&&1、淀粉酶活性的检测取一支试管，注入1%淀粉溶液5mL与稀释的唾液0.5~2mL，混匀后插入1支玻棒，将试管连同玻棒置于37℃水浴中。不时地用玻棒从试管中取出1滴溶液，滴加在培养皿上，随即加1滴碘液，观察溶液呈现的颜色。此实验延续至溶液仅表现碘被稀释后的微黄色为止。记录淀粉在水解过程中，遇碘后溶液颜色的变化。向上面试管的剩余溶液中加2mL本尼迪克特（Benedict）试剂，放入沸水中加热10分钟左右，观察有何现象？为什么？2、酶的特异性酶的特异性是指一种酶只能对一种或一类化合物（此类化合物通常具有相同的化学键）起作用，而不能对别的化合物起作用。如淀粉酶只能催化淀粉水解，对蔗糖的水解无催化作用。本实验以唾液淀粉酶（含淀粉酶和少量麦芽糖酶）对淀粉的作用为例，说明酶的特异性。淀粉和蔗糖都没有还原性，但淀粉水解产物为葡萄糖，蔗糖水解产物为果糖和葡萄糖，均为还原性糖，能与Benedict试剂反应，生成砖红色的氧化亚铜沉淀。（1）检查试剂取2只试管，按下表操作。管号试剂0.3%NaCl淀粉溶液/mL2%蔗糖溶液/mLBenedict试剂/mL13—2摇匀，沸水浴煮沸2~3min观察结果2—32&&&&（2）淀粉酶的专一性实验&&&&12&&&&&&&&取2只试管，按下表操作。管号试剂稀释200倍的唾液/mL0.3%NaCl淀粉溶液/mL2%蔗糖溶液/mL113—摇匀，置37℃水浴保温10minBenedict试剂/mL2摇匀，沸水浴煮沸2~3min观察结果3、pH对酶活性的影响酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性，酶活性最高时的pH，称为酶的最适pH，高于或低于此pH时酶的活性都逐渐降低。不同酶的最适pH不同。酶的最适pH不是一个特征性的物理常数，对于一个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。（1）取3支50mL锥形瓶，按下表的比例，制备不同浓度的缓冲液：锥形瓶号1230.2mol/L磷酸氢二钠/mL5.157.729.720.1M柠檬酸/mL4.852.280.28缓冲液pH5.06.88.0221—3&&&&（2）取三支试管，照如下操作：管号试剂pH5.0缓冲液/mLpH6.8缓冲液/mLpH8.0缓冲液/mL0.5%淀粉溶液/mL12——12—2—13——21&&&&以1分钟的间隔，依次加入稀释的唾液1mL，摇匀充分摇匀，置37℃水浴保温10min，到达保温时间后，每隔1min依次取出KI-I2溶液/滴观察结果综合以上结果，说明pH对酶活性的影响。&&&&13&&&&2&&&&2&&&&2&&&&&&&&4、温度对酶活性的影响对温度敏感是酶的一个重要特性，酶作为生物催化剂，和一般催化剂一样呈现出温度效应，提高温度可以提高酶促反应速度，但另一方面又会加速酶蛋白的变性速度，所以在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。酶反应速度达到最大时的温度称为酶的最适温度。酶的最适温度不是一个常数，它与作用时间的长短有关系。取3支试管，各加3mL1%淀粉溶液：另取3支试管，各加1mL淀粉酶液。将此6支试管分为三组，每组中盛淀粉溶液与淀粉酶液的试管各1支，三组试管分别置入0℃、37℃与100℃的水浴中。5分钟后，将各组中的淀粉溶液倒入淀粉酶液中，继续维持原温度条件5min后，立即滴加2滴碘液，观察溶液颜色的变化。根据观察结果说明温度对酶活性的影响。5、激活剂与抑制剂对酶活性的影响酶的活性受某些物质的影响，能使酶活性增加的称为激活剂，能使酶活性降低的称为抑制剂。很少量的激活剂和抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性，但激活剂和抑制剂不是绝对的，浓度的改变可能使激活剂变成抑制剂。取3支试管，按下表加入各种试剂。混匀后，置于37℃水浴中的保温。从1号试管中用玻棒取出1滴溶液，置于白磁板上用碘液检查淀粉的水解程度。待1号试管内的溶液遇碘不再变色后，立即取出所有的试管，各加碘液2滴，观察溶液颜色的变化，并解释之。管号试剂1%NaCl溶液/mL0.1%CuSO4溶液/mL蒸馏水1%淀粉溶液/mL稀释的唾液/mL11——312—1—313——231&&&&摇匀，放入37℃恒温水浴中保温10~15min，取出，冷却KI-I2溶液/滴观察结果2滴2滴2滴&&&&五、思考题&&&&1、本实验中如何通过淀粉液加碘后的颜色的变化来判断酶促反应快慢的？2、如何通过加入班氏试剂后生成沉淀多少来反映酶促反应快慢的？3、通过本实验，结合理论课的学习，小结出哪些因素影响唾液淀粉酶活性？是如何影响的？&&&&14&&&&&&&&实验四底物浓度对酶活力的影响（米氏常数的测定）&&&&一、目的要求&&&&1．学习分光光度法测定的原理和方法2．学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的km和Vm值。&&&&二、实验原理&&&&酶的底物浓度与酶促反应速度的关系一般情况下符合米氏（Michaelis-Menten）理论。根据中间产物学说，酶促反应的动力学模型可以表示为：&&&&E+S&&&&k1k-1&&&&ES&&&&k2&&&&E+P&&&&这里，E、S、ES和P分别表示酶、底物、酶底物中间物和产物；k1、k1、k2、是各步反应的速度常数。按照中间产物学说，可以推导出米氏方程为：&&&&v?&&&&Vm?[S]Km?[S]&&&&式中：[S]为底物浓度（摩尔浓度）：v为初速度（微摩尔浓度变化/min）；Vm为最大反应速度（微摩尔浓度变化/min）；Km为米氏常数（摩尔浓度）。测定Km和Vm，特别是测定Km是酶学工作的基本内容之一。在酶动力学性质的分析中，米氏常数Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力的强弱。&&&&Km数值越小，说明酶和底物的亲和力越强；反之，Km值越大，酶和底物的亲和力越弱。&&&&测定Km和Vm可通过作图法求得。作图方法很多，其共同的特点是先将米氏双曲线方程式转变为一般的直线形式。本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸酯水解的Km和Vm，采用最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法。这个方法是将米氏方程转化为倒数形式，即：&&&&1Km11?vVm[S]Vm&&&&然后以1/v对1/[S]作图，可得一条直线（图4.1），直线的纵轴上的截距为1/Vm，横轴截距为-1/Km，由此即可求Km和Vm值。本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸酯（pNPP）水解的Km和Vm。反应式：&&&&pNPP+H2O→pNP+HPO42无色黄色&&&&15&&&&&&&&可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速率v。&&&&三、试剂与器材&&&&1、试剂（1）0.1mol/LNa2CO3-NaHCO3pH10.1缓冲液（2）20mmol/LMgCl2（3）10mmol/L对硝基苯磷酸二钠（pNPP）（4）0.1mol/LNaOH（5）碱性磷酸酶2、器材（1）超级恒温水浴锅（2）秒表（3）可调微量取液器（4）722分光光度计&&&&四、操作方法&&&&1、测定取18支试管，编号。1—6号为测定管各为2支，作平行实验。1—6为对应底物浓度的对照管，按下表操作，对照管先加NaOH终止剂后补加酶液。&&&&16&&&&&&&&No.底物浓度[S]（mmol/L）10mmol/LpNPP（mL）重蒸水（mL）Na2CO3-NaHCO3（mL）MgCl2（mL）预热ALPase酶液（μL）反应时间（min）0.1mol/LNaOH（mL）空白管补加酶液OD405nm1/OD1/[S]（mmol/L）-12.数据处理&&&&10.500.10.5&&&&20.600.120.48&&&&30.750.150.45&&&&41.00.20.4&&&&51.50.30.3&&&&63.00.60&&&&各管加入1.0mL各管加入0.2mL37℃min200μL精确反应10min各管加入2.0mL1′-6′对照管补加200μL酶液&&&&2.0&&&&1.67&&&&1.33&&&&1.0&&&&0.67&&&&0.33&&&&各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值（OD405nm）。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酸的含量（μmol数），计算出各种底物浓度下的初速度v（单o位以μmolL-1·min-1表示）。以1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。本实验以OD405nm为相对速度，以1/OD对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和相对最大反应速度。&&&&五、注意事项&&&&1．取液量一定要准确。2．反应时间一定要精确。3．加酶前后一定要将试剂混匀。4．空白对照一定要先加NaOH，后加酶。5．测定OD405时要以各自的空白调零点。6．移液管或取液器的使用。&&&&六、思考题&&&&（1）在测定酶催化反应的米氏常数Km和最大反应速度Vm时，应如何选择底物浓度范围？（2）试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。（3）为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？&&&&17&&&&&&&&实验五纸层析法分离鉴定氨基酸&&&&一、目的要求&&&&(一)通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。(二)通过实验加深对氨基酸理化性质的了解。&&&&二、实验原理&&&&层析法又称色谱法。1903年，科学家发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜色的层圈。此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法（Chromatography）。虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用。分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用α表示分配系数。&&&&&&&&溶质在固定相的浓度?CS?溶质在流动相的浓度?CL?&&&&一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的OH基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。纸层析的实际操作是在滤纸的一端（通常距纸边缘2厘米），点上样品，干后，在密闭的容器内，待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中的混合物得到分离。这种操作常称单向层析。为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层析。即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶剂系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转90°，再用另一个溶剂系统展层。物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上的移动速率，用Rf表示。&&&&Rf?&&&&原点到层析点中心的距离原点到溶剂前沿的距离&&&&18&&&&&&&&若X表示原点到层析点中心的距离。X?Y表示原点到溶剂前沿的距离，则&&&&Rf?&&&&XX?Y&&&&。对于某一物质在一定条件下的α值是固定的，因Rf值的主要决定因素是分配系数（α）此Rf值为其特征常数。现将影响Rf值的因素概括如下：1、物质结构的影响：极性物质易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此Rf低于后者。—CH2—基是疏水性基团，如果分子中极性基数目不变，则—CH2—基增加，整个分子的极性就降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值亦随之增加，例如氨基酸的Rf值：甘氨酸＜亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸＜谷氨酸。极性基团的位置不同也会引起Rf变化，例如在正丁醇—甲酸—水系统中层析时，α-丙氨酸的Rf值大于β-丙氨酸。2、溶剂的影响：同一物质在不同溶剂中Rf值不同，选择溶剂系统中应使被分离物质在适当Rf值范围内（0.005到0.85之间），并且不同物质的Rf至少差别为0.05才能彼此分开。溶剂的极性大小也影响物质的Rf值。在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的Rf值随着溶剂碳原子数目增加而降低。3、pH的影响：溶剂系统的pH会影响物质极性基团的解离形式，如对于酸性氨基酸，在酸性时所带净带荷比碱性时少，带电荷越少亲水性越小，因此在酸性溶剂中Rf值较碱大。而碱性氨基酸则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。溶剂的pH还可影响有机溶剂（流动相）含水量，溶剂酸碱度大，则含水量多。对于极性物质如氨基酸来说Rf值增加，非极性物质则减少。若pH不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸（或箱）中用酸或碱的气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。4、滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密，有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中含有Ca2+、Mg2+、Cu2+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸（0.01mol/L-1或0.4mol/L-1HCL）洗涤滤纸将之除去。&&&&19&&&&&&&&5、温度的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。温度变化对Rf值影响很大，所以层析最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过±0.5℃。除上述因素影响Rf值外，样品中含有盐份和其他杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸层析图谱常用茚三酮或吲哚醌作显色剂。茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色，如含有大量盐时显色点上会出现白斑，此外空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定。用硫酸酮乙醇溶液洗脱层析后的显色班点，借比色法可定量测定氨基酸含量。&&&&三、器材及试剂&&&&1、器材层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、电吹风、层析滤纸（新华一号）2、试剂（1）展开剂：溶剂系统：正丁醇—88%甲酸—水（15：3：2，V/V）（2）氨基酸溶液：0.5%的脯氨酸、缬氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。（3）显色剂：0.1%水合茚三酮乙醇溶液。&&&&四、操作步骤&&&&1、将配好的层析液倒入培养皿中，把培养皿放入层析缸中，盖紧缸盖，放置30分钟。2、取层析滤纸（长18—20厘米，宽14厘米）一张。在垂直于纸的纹路一端距边缘1.5厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2厘米作一记号，作为点样位置（共6点），并用铅笔在点样点下端写出所点氨基酸的名称。3、点样：用毛细管吸取样品约2cm高，将各氨基酸样品分别点在这六个位置上，用电吹风吹干后再点一次，共点三次。每点在纸上扩散的直径最大不超过5毫米。4、扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤纸直立于培养皿中，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1厘米。当前沿线到达层析纸2/3-3/4处时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，用电吹风热风吹干。5、显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三铜溶液，然后用热风吹干即可显出各层析斑点。&&&&20&&&&&&&&6、用铅笔画出层析斑点并算出Rf值。&&&&五、注意事项&&&&1、为了防止滤纸被手上的汗液污染，在操作时带手套。2、重复点样时可用吹风机的冷风吹干样品，喷了茚三酮后的显色则要用热风吹干滤纸。&&&&六、思考题&&&&1、如何用纸层析法对氨基酸进行定性和定量的测定？2、纸层析和柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？3、请对试验中所用的几种氨基酸移动快慢的原因给予简要分析。&&&&21&&&&&&&&实验六蛋白质含量的测定—双缩脲法测定血清总蛋白&&&&一、目的要求&&&&1．学习分光光度定量分析法的原理。2．学习并掌握标准工作曲线进行物质定量分析的原理与方法。3．学习并掌握双缩脲法测定血清总蛋白质浓度的实验技术。4．了解蛋白质含量常见测定方法。&&&&二、常见蛋白质测定方法介绍&&&&（一）微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量1、原理&&&&天然有机物（如蛋白质和氨基酸等化合物）的总氮量通常用微量凯氏定氮法（Micro–KjeldahlMethod）的测定。当被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氮，氨与硫酸反应生成硫酸铵，此过程称为消化。由于消化过程进行缓慢，实验中常添加硫酸钾和硫酸铜的混合物来促进，硫酸铜是催化剂，硫酸钾可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨入无机酸溶液中，然后再用标准液定，滴定所用无机酸的量（mol）相当于被测样品氨的量（mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量，上述过程的化学反应如下：（1）消化有机氮物（C、H、O、N、P、S）＋浓H2SO4→CO2+NH3↑+SO2+H3PO4NH3+H2SO4→（NH4）2SO4（2）蒸馏（NH４）2SO４＋ＮａＯH→Na2SO4+H2O+NH3↑（3）吸收NH3+H3BO3→NH4HB4O7+H2O（4）滴定NH4HB4O7+HCl→NH4Cl+H3BO3在微量凯氏定氮法中，常用硼酸-指示剂混合液收集氨，氨与溶液中氢离子结合生成氨离&&&&22&&&&&&&&子，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度，即指示剂变回原来颜色为止。所用无机酸的摩尔数既相当于样品中氨的摩尔数。本法适用范围约为0.2-1mg氨因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。&&&&2、试剂和器材&&&&（1）试剂①浓硫酸（AP）；②粉末硫酸钾－硫酸铜混合物：K2SO4:CuSO4?5H2O=3:1、6：1或10：1；③40%（W/V）氢化钠溶液；④4%（W/V）硼酸溶液；&&&&⑤0.01moL/L标准盐酸（用硼砂标定）：吸收分析纯盐酸（比重1.19，约12moL/L）8.5mL，用蒸馏水稀释至1L，贮于试剂瓶中待标定。准确称取3份干燥的硼砂，每份0.381－0.383g分别放在150mL三角瓶中，加入20mL蒸馏水使其溶解，加入三滴甲基红指示剂（0.1g甲基红溶于250mL水中），用待测的盐酸滴定至橙红色为止，记下盐酸的滴定体积，通过计算即可知道盐酸的准确浓度：&&&&CHCl?&&&&W?1000Mr?V&&&&式中，W为硼砂称量（g）：V为HCl的滴定体积（mL）；Mr为硼砂分子量。⑥混合指示剂贮备液：取50mL0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1%甲基红乙醇溶液混合而成，贮于棕色瓶中备用。此指示剂在pH5.2为紫色；pH5.4为暗蓝色（或灰色）：pH5.6绿色。变色范围很窄，变色点pH为5.4，故混合指示剂很灵敏。⑦标准硫酸氨溶液（0.3mg氨/mL）：取141.6mg分析纯硫酸氨，如水溶解，定容至100mL。（2）待测样品：豆浆（市售）（3）器材①微量凯氏定氮仪，②50mL凯氏烧瓶，100mL锥型瓶，50mL酸式滴定管，100mL量筒，100mL容量瓶，100mL烧杯，酒精灯&&&&3、操作方法&&&&23&&&&&&&&（1）样品的消化在凯氏烧瓶中加入催化剂约50mg，用移液管依次加入3mL均一的豆浆和3mL浓硫酸（移液管要接近凯氏烧瓶底部，不使样品粘附在瓶口或瓶颈）。另取一支凯氏加入3mL水代替豆浆，其余试剂同上，此为空白。将凯氏烧瓶放在通风柜内的电炉上加热，火力不要太猛，应以使液体保持微沸状态为宜。瓶内液体逐渐由黄色变为黑色，继而转为淡黄色，最后成清澈淡蓝色溶液，消化即告完全，取出烧瓶，冷却，将瓶内液体转移至50mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（2）仪器的装置和蒸洗装好凯氏定氮仪（图6.1），再用蒸气蒸洗，以除去NH3和其它干扰物质。方法如下：接通冷凝水，打开夹子（J），往蒸馏瓶(B)内加入占求部1/3体积的清水，而后取5mL蒸馏水从小漏斗（A）缓缓地注入反应瓶（F），关上夹子（1），同时加热蒸馏瓶（B），蒸馏反应瓶内的蒸馏水，使其沸腾产生蒸气。产生的气体沿导管上升到冷凝管（C），气体经过冷却从冷凝管末端（C）流入收集瓶。排出反应瓶（F）中的液体，重复蒸洗2～3次。反应瓶（F）中的液体排出的方法：样品蒸馏完毕后，继续加热使其沸腾，移开酒精灯，关上夹子（1），稍等片刻，由于蒸馏瓶（B）中的蒸气较反应瓶（F）中的多，所以冷却后蒸馏瓶（B）中的压力比反应瓶（F）的低，反应瓶（F）内的废液迅速地从出样口（H）抽出到反应瓶外，随即自加样小漏斗（A）往反应瓶（F）中较快地倒入一些冷蒸馏水，关上夹子（1），稍等片刻，反应瓶（F）内的液体又迅速地从出样口（H）抽出，然后打开夹子（K）排出蒸馏瓶中的热水，关上夹子（K），打开夹子（J），往蒸馏瓶（B）中加入1/3球部体积的清水，即可进行下一次蒸馏。仪器的安装蒸洗过程中，应很好地掌握几个夹子的开关关系，避免漏气是实验成败的关键步骤。&&&&图6.1凯氏定氮仪示意图A.小漏斗；B.蒸馏瓶；C.冷凝管；D.入水口；E.出水口；F.反应瓶；G.冷凝管末端；H..出样口；I、J、K.夹子&&&&24&&&&&&&&（3）标准硫酸铵的测定①吸取10mL4%硼酸溶液注入三角烧瓶，加入2滴指示剂，将其倾斜地放在冷凝管末端（G）下，使管末端插入溶液内。②用移液管准确吸取5mL标准硫酸氨溶液置于小漏斗（A），小心打开夹子（1），使其缓慢流入反应瓶（H），用1～2mL蒸馏水冲洗漏斗后放入反应瓶（H）。③量取5mL40%NaOH溶液，置小漏斗（A），小心打开夹子，使其缓慢流入反应瓶（H），同样用1～2mL蒸馏水冲洗漏斗后放入反应瓶（H）。关上夹子（1），避免蒸馏过程中氨散失。④加热蒸馏瓶（B）使反应瓶内液体开始沸腾，立即收集氨，当三角瓶中溶液由紫红色变成鲜绿色开始记时，蒸馏5min后移动三角瓶使液面离开冷凝管口约1cm，继续收集2-3min，最后用蒸气水蒸洗反应瓶一次，就可以进行第二份标准硫酸氨溶液的蒸馏工作。⑤将收集的各瓶蒸馏分别用0.010moL/L标准盐酸溶液滴定至蓝色消失，使溶液呈淡桔红色为止。用标准硫酸铵溶液连续测定三次，三次测定的终点颜色反应一致，滴定数据差值不超过±0.05mL.（4）样品及空白的测定将1操作所得的消化液在氮仪上进行含氮量测定，方法与标准硫酸氨溶液测定相同，并进行空白测定。（5）结果处理&&&&样品含氮量(mg/mL)?&&&&(A?B)?C?14?NV&&&&若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则&&&&样品中的蛋白质含量(mg/mL)?&&&&(A?B)?C?14?6.25?NV&&&&式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数，B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数，V为样品的毫升数，C为盐酸的准确摩尔浓度，14为氮的原子量，6.25为系数，N为样品的稀释倍数。按上面公式计算每毫升标准硫酸氨溶液的含氮量（mg/mL）和每毫升豆浆中的蛋白质含量（mg/mL）。&&&&25&&&&&&&&4、注意事项&&&&（1）如果测定的样品不是纯蛋白，测定的总氮量中很可能包含非蛋白氮，若要进行比较准确的测定，就必须分别测定样品中的蛋白氮和非蛋白氮。后者的测定是样品制成匀浆或抽提液，用三氯醋酸或氢氧化铜等蛋白质沉淀剂将蛋白质沉淀，然后按测定总氮的方法分析上清液，便得到非蛋白氮。把总氮量减去非蛋白氮量即得蛋白氮量。将蛋白氮量乘以6.25便是蛋白质的含量。（2）为保证所有硫酸铵都能转化为氨，需要使溶液呈强碱性，所以要加足量的40%NaOH溶液。加入时应缓慢进行，以免产生剧烈反应导致接受瓶内硼酸溶液的倒吸和氨的损失。碱液加入后，有铜氨离子、氢氧化铜或氧化铜等化合物生成，溶液呈蓝色或褐色，并有胶状沉淀产生，这是正常现象。反之，如果颜色不变，说明碱液可能不够。（3）蒸馏时要避免火力不稳，否则会发生样品被倒吸到蒸馏瓶的现象。（4）在进行下一次蒸馏时，要先讲蒸馏瓶中的热水放掉，加入冷水，否则也会发生样品被倒吸到蒸馏瓶的现象。&&&&5、思考题&&&&（1）写出以下各步的化学反式a.蛋白质的消化；b.氨的蒸馏；c.氨的吸收；d.氨的滴定（2）测定标准硫酸氨和空白的目的是什么？（3）消化时加钾-硫酸铜混合物的作用是什么？&&&&（二）双缩脲法测定血清总蛋白浓度1、原理&&&&双缩脲反应是蛋白质重要的颜色反应。具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可用来测定蛋白质的浓度。在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质浓度溶液同时反应，并于540nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。本法测定蛋白质范围1-10mg。&&&&H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2→H2N-CO-NH-CO-NH2+NH3&&&&双缩脲双缩脲产物可能为：&&&&26&&&&&&&&OHOCOCNH2NHCu&&&&OHNH2HNCOCO&&&&NH2NaNaH2NOHOH&&&&2、分光光度法测定物质含量的原理&&&&分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的技术。因为分光光度法极为灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分的系统中，不需要分离，即使检测出其中所含的极少量物质，因此分光光度法目前已成为生物化学研究中广泛使用的方法之一。当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分在容易的表面或分散，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只要一部分光可透过溶液。入射光=反射光+分散光+吸收光+透过光如果我们用蒸馏水（或组成此溶液的熔剂）作为―空白‖去校正反射，分散等因素造成的入射光的损失，则入射光=吸收光+透过光I0为经过空白校正后入射光的强度；l为透过光的强度。根据实验得知：&&&&I?I010cl&&&&式中，c表示吸收物质的摩尔浓度；L表示吸收物质的光径，用cm表示；e表示吸收物质的摩尔消光系数，它表示物质对光的吸收特质的e数值不同。&&&&所以&&&&I?10clI0&&&&T(透射比)?II，则T%100I0I0&&&&令&&&&∴&&&&T?10cL&&&&由上式可得&&&&27&&&&&&&&lg&&&&lg&&&&∴&&&&1cLT&&&&1为物质的消光值（E）或吸光度（A）。T&&&&AcL&&&&若以A对物质的浓度作图，则得—直线。上式说明了物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比，这就是Beer-Lambert定律。&&&&3、试剂与器材&&&&（1）试剂①6mol/LNaOH溶液称取NaOH240g，溶于新鲜制备的蒸馏水（或刚煮沸冷却的去离子水）约800ml中，冷却后稀释至1L，贮于有盖塑料瓶中。若用非新开瓶的NaOH，须先配成饱和溶液，静置2周左右，使碳酸盐沉淀，其上清饱和NaOH溶液经定后，算出准确浓度再使用。②双缩脲试剂。称取硫酸铜结晶(CuS04,5H20)3g溶于新鲜制备的蒸馏水（或ju煮沸冷却的去离子水）500ml中，加入酒石酸钾钠（NaKC4H406·4H20，用以结合Cu2、，防止Cu0在碱性条件下沉淀）9g．和KI（防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu20的离析）Sg，待完全溶解后，在搅拌下加入6mol/LNaOH溶液100ml，并用蒸馏水稀释至1L，置塑料瓶中盖紧保存。此试剂室温下可稳定半年，若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。，③双缩脲空白试剂除不含硫酸铜外，其余成分与双缩脲试剂相同。④60—70g/L蛋白标准液常用牛血清白蛋白或收集混合血清（无黄疸、无溶血、型肝炎表面抗原阴性、肝肾功能正常的人血清），经凯氏定氮法定值，亦可用定值参⑤血清或标准白蛋白作标准。但定值质控血清定值准确性较差，不能用作血清总蛋白测定的标准物。（2）器材722型分光光度计、水浴锅&&&&4、操作步骤&&&&取试管5支，标明测定管（U1、U2）、标准管（S）、标本空白管（B）、试剂空白管（RB），按表6-1操作。&&&&28&&&&&&&&表6-1双缩脲法测定血清总蛋白操作步骤&&&&加入物（mL）样品1（血清）样品2（血清）蛋白标准液蒸馏水双缩脲空白试剂&&&&双缩脲试剂&&&&B0.100.10——5.0—&&&&RB&&&&S&&&&U10.10&&&&U2&&&&——0.10—5.0&&&&—0.10——5.05.0&&&&0.10———5.0&&&&混匀，置25℃30min或37℃10min，用蒸馏水调零，在波长540nm处测定各管吸光度。&&&&5、结果计算&&&&血清总蛋白（g/L）=&&&&6、注意事项&&&&AU-ARB-AB?蛋白标准液浓度AS-ARB-AB&&&&（1）样品测定参考值：60—80g/L。（2）须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。（3）黄疸血清、严重溶血、葡聚糖、酚酞及溴磺酞钠对本法有明显干扰，故用标本空白管来消除。但如标本空白管吸光度太高，可影响测定的准确度。（4）高脂血症混浊血清会干扰比色，可采用下述方法消除：取2支具塞试管或离心管，各加待测血清0.1ml，再加蒸馏水0.5ml和丙酮10ml，塞紧并颠倒混匀10次后离心，倾去上清液，将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述相同的其他操作和计算。7、临床意义（1）血清总蛋白浓度降低①蛋白质合成障碍：当肝功能严重受损时，蛋白质合成减少，以白蛋白降低最为显著。②蛋白质丢失增加：严重烧伤，大量血浆渗出；大出血；肾病综合征尿中长期丢失蛋白质；溃疡性结肠炎可从粪便中长期丢失一定量的蛋白质。③营养不良或消耗增加：营养失调、低蛋白饮食、维生素缺乏症或慢性肠道疾病所引起的吸收不良，使体内缺乏合成蛋白质的原料；长期患消耗性疾病，如严重结核、恶性肿瘤和甲状腺功能亢进等，均可导致血清总蛋白浓度降低。④血浆稀释：如静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留。（2）血清总蛋白浓度增高①蛋白质合成增加：大多见于多发性骨髓瘤患者，此时主要是异常球蛋白增加，使血清总蛋白增加。&&&&29&&&&&&&&②血浆浓缩：如急性脱水（如呕吐、腹泻、高烧等），外伤性休克（毛细血管通透性增大），慢性肾上腺皮质功能减退（尿排钠增多引起继发性失水）。&&&&8、方法评价&&&&双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系，与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成无明显关系，各种蛋白质的显色程度基本相同；本法重复性好，RCV为4%，CCV为3.9%；线性范围为0～140g/L；本法干扰少，常见干扰大多可以避免；使用单一的稳定试剂，操作简便、快速，既适于手工操作，也便于自动化分析，已被推荐为测定血清总蛋白的参考方法。本法唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍。但本法的检出限为0.2—1.7mg蛋白质/ml，这相当于70g/L的血清3—24?L，已能满足临床生化检验的需要。因此，本法是临床测定血清总蛋白质首选的最方便、实用的常规方法。&&&&（三）Folin-酚试剂法（Lowry法）测定蛋白质浓度1、原理&&&&蛋白质含有两个以上的肽键（-CO-NH-），因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂（磷钼酸-磷钨酸试剂），蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。一定条件下蓝色强度与蛋白质正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外线吸收法灵敏10-20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种干扰。对双缩脲反应干扰的基因，如-CO-NH2、-CH2-NH2、-CS-NH2，在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖、硫酸铵、疏基化合物等均可干扰Folin-酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。在测试时应排除干扰因素或做空白实验消除。浓度较低的尿素（约0.5%怎样）、硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、乙醚（5%）、丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加碳酸钠-氢氧化钠溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须将碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度提高1-2倍。Folin-酚试剂由甲试剂与乙试剂组成。Folin-乙试剂仅在酸性PH下稳定，但上述还原反应只在pH10的情况下发生，故Folin-乙试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应能发生。本法可测定范围是25-250pg蛋白质。&&&&2、试剂和器材&&&&（1）试剂①试剂甲：（A）4%碳酸钠（Na2CO3）溶液&&&&30&&&&&&&&（B）0.2mol/L氢氧化钠NaOH溶液（C）2%酒石酸钾钠溶液（或酒石酸钾、酒石酸钠）（D）1%硫酸铜（CuSO4。5H2O）溶液临用前将混合，此混合液即为试剂甲。混合后的溶液一天内有效。②Folin-酚试剂（试剂乙）在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100%钨酸钠（Na2WO.2H2O），25g钼酸钠（Na2MoO.2H2O），及700mL重蒸水，50mL85%磷酸，100mL浓盐酸充分混合，烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出，接上回流冷凝管以文火回流10.h。回流结束后，加入150g硫酸锂（LiSO4），50mL重蒸水及数滴液溴，开口继续沸腾15min，以除去多余的溴。冷却后溶液呈金黄色（如果仍呈绿色，须在重复滴加溴水的步骤），定容至1L，过滤，滤液置棕色瓶中保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时标准NaOH滴定酸度，以酚酞为指示剂。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度使用，即为Folin-酚试剂。③标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，再根据其纯度配制成500μg蛋白/mL溶液。（2）测试样品血清使用前稀释100倍或约含20-250μg/mL蛋白质的样品溶液。（3）器材①722型分光光度计②恒温水浴锅③试管及试管架④0.5mL，1mL及5mL移液管&&&&3、操作方法&&&&（1）蛋白浓度标准曲线的制作取14支试管，分两组按下表平行操作试管编号试剂处理蛋白含量（μg）标准蛋白溶液（mL）重蒸水（mL）Folin-酚甲试剂（mL）Folin-酚乙试剂（mL）.050...30各管加入4mL混匀，于20-25℃放置10min各管加入0.5mL迅速混匀，30℃（或室温20-25℃）水浴保温30min，以0号管为空白对照，在650nm处比色OD650绘制标准曲线：以OD650值为纵坐标，标准蛋白量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。&&&&31&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&（2）样品溶液蛋白质浓度测定取6支试管，分两组，按下表平行操作试管编组试剂处理样品溶液（mL）重蒸水（mL）Folin-酚甲试剂（mL）Folin-酚乙试剂（mL）OD650（3）计算空白管（×3）00.5各管加入4mL混匀，于室温20-25℃放置10min各管加入0.5mL迅速混匀，于30℃（或室温20-25℃）保温30min样品管（×3）0.50&&&&蛋白质浓度（mg/mL）?&&&&（4）注意事项&&&&OD650值对应标准曲线蛋白含量?10?3?样品溶液稀释倍数测定时所用样品溶液mL数&&&&（1）Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin-酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质反应生成碱性的铜-蛋白质溶液。因此当Folin-酚乙试剂加入后，后立即混匀，使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂破坏之前。（2）血清应适当稀释使其蛋白质的含量在标准范围内。&&&&4、思考题&&&&（1）Folin-酚法测定蛋白含量的原理是什么？（2）有哪些因素会干扰Folin-酚法测定蛋白含量？&&&&（四）考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度1、原理&&&&考马斯亮蓝（CoomassieBnlliant）测定蛋白浓度，是利用蛋白质—染料结合的原理。考马斯亮G-250存在这两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形成转变成蓝色形式，最大光吸收由564mm变成595mm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合朗伯-比尔定律（Lambert-Beer‘slaw）,因此可以通过测定染料在595mm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h左右，因此测定过程快速，且不需要严格的时间控制。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时很高，在测定溶液中含蛋白质5?g/mL是就有0.275光吸收的的变化，比Lowry法灵敏4倍。测定范围为10-100?g蛋白质，微量测定法测定范围是1-10?g蛋白质。此法反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大是稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试&&&&32&&&&&&&&剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。此方法干扰物少，研究表明NaCl、Kgl、MgCl2、乙醇、（NH4）2SO4不干扰测定。强碱性缓冲剂在测定中有一些颜色干扰，可以适当的缓冲液对照扣其影响。Tris、乙酸、疏基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA、微量的去污剂（如TritonX-100.SDS）和玻璃去污剂均有少量颜色干扰用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。由于该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高，现已广泛应用蛋白质含量测定。&&&&2、试剂和器材&&&&（1）试剂①标准蛋白质溶液&&&&1%结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白OD1cm?6.6测定蛋白质含&&&&量，再用0.15moL/LNaCl，0.1mg/mL蛋白溶液。②考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）磷酸。（2）待测样品未知蛋白质溶液，要求蛋白浓度范围为.01-5mg/mL，若浓度过高时，需用0.15mol/LNaCl溶液适当稀释。（3）器材①722型分光光度计②微量进样器③移液器④试管及试管器&&&&3、操作方法&&&&（1）标准法制作标准曲线取14支试管，分两组按下表平行操作。试管编号试剂处理标准蛋白含量（μg）1mg/mL标准蛋白溶液（mL）0.15mol/LNaCl（mL）考马斯亮蓝试剂（mL）OD650（2）微量法制作标准曲线取12支试管，分两组按下表平行操作。&&&&33&&&&0000.10&&&&&&&&&&&&mL&&&&&&&&&&&&&&&&摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色&&&&&&&&试管编号试剂处理标准蛋白含量（μg）1mg/mL标准蛋白溶液（mL）0.15mol/LNaCl（mL）考马斯亮蓝试剂（mL）OD595nm&&&&0000.10&&&&110.010.09&&&&230.030.071mL&&&&350.050.05&&&&470.070.03&&&&590.090.01&&&&摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。（3）未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的OD595mm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。（4）注意事项（1）如果测定要求严格，可以在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色最稳定。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸收量可以忽略。测定完可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。&&&&4、思考题&&&&（1）与其它测定蛋白质浓度的方法相比，考马斯亮蓝染色法测定有何优点？&&&&（五）紫外分光光度法测定蛋白质浓度1、原理&&&&由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280mm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（OD280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）得到广泛应用。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。根据蛋白质和核酸的吸收高峰不同，并利用这一性质，通过计算可以适当校正核算的干扰作用。&&&&2、试剂和器材&&&&34&&&&&&&&（1）试剂①标准蛋白质溶液：准确称取经微量凯氏定氮法校正的标准蛋白质，用重蒸水配制成浓度为1mgmL的溶液。②待测蛋白质样品溶液：用重蒸水适当稀释。（2）器材①752型紫外分光光度计②移液管③试管和试管架&&&&3、操作方法&&&&（1）标准曲线法①标准曲线的绘制试管编号标准蛋白质溶液(mL)蒸馏水（mL）蛋白质浓度（mg/mL）OD280选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm处分别测定各管溶液的OD280值。以蛋白质浓度为横坐标，OD280值为纵坐标，绘制标准曲线。②样品测定取适当浓度的待测定蛋白质溶液，同样选用光程为1cm的石英比色杯，测定280nm处的光吸收值，并从标准曲线上查出待测定蛋白质的浓度。（2）其它方法①将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm和280nm处分别测定出OD值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。蛋白质浓度（mg/mL）=1.45OD280-0.74OD260式中OD280和OD260分别是蛋白质溶液在280nm和260nm波长下测得的光吸收值。此外，也可先计算出的OD280/OD260比值后，从表3.1中查出校正因子―F‖值，同时可查出样品中混杂的核酸的百分含量，将―F‖值代入，再由下述经验公式直接计算出该溶液的蛋白质浓度。104.......&&&&蛋白质浓度（mg/mL）=&&&&F?&&&&1?OD280?Nd&&&&式中OD280为该溶液在280nm下测得的吸光值：d为石英比色杯的厚度（cm）;N为溶液&&&&35&&&&&&&&的稀释倍数。表1紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子280/.521.401.361.301.251.161.091.030.4核酸（%）0.000.250.500.751.001.251.502.002.503.003.504.005.00因子（F）1.41.00.20.30.0.40.30.10.5核酸（%）5.506.006.507.007.508.009.14.因子（F）0.70.50.20.8&&&&注：一般纯蛋白质的光吸收比值（OD280/OD260）约为1.8，而纯核酸的比值约为0.5②对于稀蛋白质溶液，还可用215nm和225nm的吸收差来测定浓度。从吸收差与蛋白含量的标准曲线即可求出浓度。吸收差△OD=OD215-OD225式中的OD215和OD225分别是蛋白质溶液在215nm和225nm波长下测得的光吸收值。此法当蛋白质含量在20-100ug/mL的范围内，是服从Beer定律的。氯化钠、硫酸铵以及0.1mol/L磷酸、硼酸和三羟甲基烷等缓冲液都无显著干扰作用。但是0.1mol/L乙酸、琥珀酸邻苯二甲酸以及巴比妥等冲液在215nm波长下的吸收较大，不能应用，必须降至5mmol/L才屋显著影响。由于蛋白质的紫外吸收高峰常因pH的改变而出现高低变化，故采用紫外吸收法要注意溶液的pH，最好与标准曲线制订时的pH一致。&&&&1%③如果已知某一蛋白质在280nm波长处的吸收值OD则取该蛋白质溶液于280nm处1cm，&&&&测定光吸收值后，便可直接求出都不知道浓度。&&&&4、思考题&&&&（1）简述紫外分光光度测定蛋白质浓度的原理及优点。&&&&36&&&&&&&&实验七核酸的定量测定（一）—DNA的定量测定&&&&一、实验目的&&&&学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的方法。&&&&二、实验原理&&&&核酸含量的测定方法包括紫外吸收法、定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法。本实验采用针对DAN的二苯胺法测DNA的含量。在酸性溶液中，DNA与二苯胺共热生成蓝色化合物，该物质在595nm有量大吸收，在40~400mg/mL范围内其峰值与DNA含量成正比。&&&&三、试剂和器材&&&&1、试剂（1）DNA标准液（1000mL，200μg/mL）：取DNA钠盐0.2g以0.01NNaOH溶液至1000mL溶液。（2）样品液：用0.01NNaOH冲稀或用0.05gDNA溶解至500mL溶液。（3）二苯胺试剂（4000mL）：40g二苯胺+4000mL冰乙酸+400mL高氯酸。先配100mL1.6%乙醛（1.6mL原液加水至100mL），临用前2000mL加20mL。2、器材可见分光光度计、恒温水浴锅、分析天平&&&&四、操作步骤&&&&1、标准曲线的制作取12只试管分成6组，按下表操作。取2管的平均值，以DNA浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。试管标准DNA/mL蒸馏水/mL二苯胺试剂/mL光密度值2、样品的测定取待测样品2mL，加入二苯胺溶液4mL，摇匀，60℃保温1h，然后在595nm波长出测定光密度值。根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的DNA的?g数，按下式计算待测样品的DNA的含量。002.0.81.1.60.&&&&60℃恒温水浴中保温1h，冷却，在595nm波长处比色&&&&37&&&&&&&&DNA%?&&&&五、注意事项&&&&待测样品中测得的DNA的mg数?100%待测样品液中样品的mg数&&&&其他糖及糖的衍生物、芳香醇、蛋白质等都对实验有干扰，测定前应尽可能除去。&&&&六、思考题&&&&1．DNA含量测定的方法有哪些？各有何优缺点？2．简述二苯胺法测DNA的基本原理。&&&&38&&&&&&&&实验七核酸的定量测定（二）—RNA的定量测定&&&&一、实验目的&&&&掌握用地衣酚法测定RNA含量的原理和方法。&&&&二、实验原理&&&&当RNA与地衣酚试剂在沸水中加热时，RNA被酸降解，所产生的核糖进一步转变为糖醛，它与地衣酚（3，5-二羟基甲苯）在高铁离子的催化下可反应生成绿色物，后者在670nm处有最大吸收峰，在10~100mg/mL范围内其光密度值与RNA浓度有线形关系。&&&&三、试剂和器材&&&&1、试剂（1）0.1mg/mLRNA标准液（1000mL）：取0.1g加水至1000mL。（2）RNA样品液（500mL）：取0.03g加水至500mL。（3）地衣酚试剂（2000mL，分2瓶）：2g三氯化铁加浓盐酸至2000mL溶液。临用前1000mL加1g地衣酚。2、器材可见分光度计、恒温水浴锅&&&&四、操作步骤&&&&1、标准曲线的绘制取12只试管分成6组，按下表操作。取2管的平均值，以DNA浓度为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。试管02.0.81.1.60.&&&&标准RNA/mL蒸馏水mL地衣酚试剂/mL光密度值2、样品的测定&&&&混合均匀后，置沸水浴中加热45min，冷却，在670nm波长处比色&&&&取待测样品1mL，加蒸馏水1mL及二苯胺溶液2mL，沸水浴保温45min，冷却，然后在670nm波长出测定光密度值。根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的RNA的mg数，按下式计算待测样品的RNA的含量。&&&&39&&&&&&&&RNA%?&&&&待测样品中测得的RNA的?g数?100%待测样品液中样品的?g数&&&&五、注意事项&&&&样品蛋白质含量高时，应先用5%TCA沉淀蛋白质；有较多DNA样品时也会发生干扰，可在试剂中加适量的CuCl2·H2O，可减少DNA的干扰。&&&&40&&&&&&&&实验八维生素C的定量测定&&&&一、目的要求&&&&1．学习维生素C定量测定的一般原理，掌握用2，6二氯酚靛酚滴定法和碘量法定量测定食物和生物体液中维生素C的基本操作技术。2．概括了维生素C的生理意义及其在新鲜水果和蔬菜中的含量。&&&&二、实验原理&&&&维生素C是人类膳食中必需的维生素之一，如果缺乏维生素C，将导致坏血病发生。因此，维生素C又称为抗坏血酸，有防治坏血病的功效。抗坏血酸在自然界分布十分广泛，存在于新鲜水果和蔬菜中，尤其是柠檬果实和一些绿色植物（如青辣椒、菠菜等）中含量特别丰富。抗坏血酸在机体同具有广泛的生理功能，已知体内许多重要物质的代谢反应都需要抗坏血酸的参与。它是脯胺酸羟基化酶的辅酶，故有增进胶原蛋白合成的作用，机体中许多含巯基的酶，需要依赖于作为还原剂的抗坏血酸的保护，使酶分子的巯基处于还原状态，从而维持其催化活性。由于抗坏血酸的氧化还原作用，它可促进免疫球蛋白的合成，增强机体的抵抗力。同时还能使氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽（简称GSH），而GSH可与重金属结合而排出体外，因此维生素C常用于重金属的解毒。此外，抗坏血酸尚有许多其他生理功能，但其作用机理还十分不清楚。抗坏血酸是一种不饱和的多羟基内酯化合物，稍有酸味的糖类白色晶体，易溶于水，故属于水溶性维生素。在溶液中其分子内C2和C3之间的烯醇式羟基上的氢极易解离并释放出H+，而被氧化成脱氢抗坏血酸，氧化后仍具有维生素C的生理活性，但它易分解为二酮古洛糖酸，此化合物不再具有维生素C的生理活性。维生素C有很强的还原性，在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，易被氧化而破坏。还原型和氧化型抗坏血酸可以互相转变，在生物组织中自成一氧化还原系统。由于维生素在营养学和临床方面的重要意义，故对食物和生物材料中维生素含量的测定是十分必须的。抗坏血酸的定量测定方法很多，有2，6二氯酚靛酚（简称DCIP）滴定法、碘滴定法、2，4-二硝基苯胼法、Folin试剂比色法、紫外吸收法等。&&&&方法一2，6-氯酚靛酚滴定法&&&&一、原理&&&&维生素C测定广泛采用的是DCIP滴定法，它具有简便、快速、比较准确等优点，适用于&&&&41&&&&&&&&许多不同类型样品的分析。缺点是不能直接测定样品中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的含量，易受其他还原物质的干扰。如果样品中含有色素类物质，将给滴定终点的观察造成困难。在酸性环境中，抗坏血酸（还原型）能将染料2，6-DCIP还原成无色的还原型。2，6-DCIP，而抗坏血酸则被氧化成脱氢抗坏血酸。氧化型的2，6-DCIP在中性或碱性溶液中呈蓝色，但在酸性溶液中则呈粉红色。因此，当用2，6-DICP滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸未被全部氧化前，滴下的2，6-DCIP立即被还原成无色，一旦溶液中的抗坏血酸全部被氧化时，则滴下微量过剩的2，6-DCIP便立即使溶液显示淡粉红色或微红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。依据滴定时2，6-DCIP标准溶液的消耗量（mL），可以计算出被测样品中抗坏血酸的含量。氧化型2，6-DCIP与还原型抗坏血酸常在稀草酸或偏磷酸溶液中进行反应。即先将样品溶于一定浓度的酸性溶液中或经抽提后，再用2，6-DCIP标准溶液滴定至终点。食物和生物材料中常含有其他还原物质，其中有些还原物质可使2，6-DCIP还原脱色。为了消除这些还原物质对定量测定的干扰，可用抗坏血酸氧化酶处理，破坏样品中还原型抗坏血酸后，再用2，6-DCIP滴定样品中其他还原物质。然后从滴定未经酶处理样品时2，6DCIP标准溶液的总消耗量中，减去滴定非抗坏血酸还原物质2，6-DCIP标准溶液的消耗量，即为滴定抗坏血酸实际所消耗的2，6-DCIP标准溶液的体积，由此可以计算出样品中抗坏血酸的含量。另外，还可利用抗坏血酸和其他还原物质与2，6-DCIP反应速度的差别，并通过控制样品溶液量。另外，还可利用抗坏血酸和其他还原物质与2，6-DCIP反应速度的差别，并通过控制样品溶液在PH1—3范围内，进行快速滴定，可以消除或减少其他还原物质的作用，一般在这样的条件下，干扰物质与2，6-DCIP的反应是很慢的或受到抑制。生物体液（如血液、尿等）中的抗坏血酸的测定比较困难，因为这些样品中抗坏血酸的含量很低，并且存在许多还原物质的干扰，同时还必须预先进行脱蛋白处理。在生物体液中含有巯其、亚硫酸盐及硫代硫酸盐等物质，它们都能与DCIP反应，但反应速度比抗坏血酸慢得多。样品中巯基物质对定量测定的干扰，通常可以藉加入对-氯汞苯甲酸（简称PCMB）而得到消除。本实验采用2，6-二氯酚靛酚滴定法，以新鲜水果、蔬菜和生物体液为分析材料，进行抗坏血酸含量测定。&&&&二、器材及试剂&&&&1、材料松针、新鲜蔬菜（辣椒、青菜、西红柿等）、新鲜水果（桔子、柑子、橙、柚等）、生物体液（血清、血浆等）&&&&42&&&&&&&&2、器材天平、容量瓶、锥形瓶、组织捣碎机、滴定管、抽滤装置3、试剂（1）2%草酸溶液：草酸2g，溶于100mL蒸馏水。（2%草酸液可用4%偏磷酸-醋酸溶液代替）（2）1%草酸溶液：溶1g草酸于100mL蒸馏水。（3）标准抗坏血酸溶液：准确称取50.0mg纯抗血酸，溶于1%草酸溶液，并稀至500mL，贮棕色瓶、冷藏，最好临用时配制。（4）1%HCl溶液。（5）0.1%2，6-二氯酚靛酚溶液：溶250mg2，6-二氯酚靛酚于150mL含有52mgNaHCO3热水中，冷却后加水稀释至250mL，滤去不溶物，贮棕色瓶内，冷藏（4℃约可保存一至三周）。每次临用时稀释10倍，并以标准抗坏血酸溶液标定。（6）对-氯汞苯甲酸（简称PCMB）溶液（2mg·mL-1）称取100mgPCMB溶于50mL0.05mol·L-1NaOH溶液中，过滤后滤液保存备用。（分析尿液样品用）（7）抗坏血酸氧化酶（-20℃保存）&&&&三、操作步骤&&&&1、不同样品用不同方法提后滴定（1）水果汁样品将果汁充分摇匀后，取5mL样品放入50mL容量瓶中，用2%草酸溶液（或4%偏磷酸醋酸）溶液稀释，并定容至50mL，混匀后通过快速滤纸过滤（或离心）。取滤液10mL放入锥形瓶内，立即用已标定过的2，6-DCIP溶液快速滴定至样品液呈现玫瑰色，并保持15—20s不变即为终点，记录所消耗的2，6-DCIP溶液的体积（mL）。样品液中抗坏血酸含量宜在0.1—0.2mg·mL-1范围内，如果偏高或偏低则可酌情增减样品用量或进行适当稀释。另收10mL蒸馏水作空白对照滴定。样品液和空白对照均至少各做3份，滴定结果取平均值，随时分别做好数据记录。检测果汁（或其他样品）中干扰物质的存在，可取5mL新鲜果汁放入50mL容量瓶中，加少许抗坏血酸氧化酶晶体，轻轻混匀，放置10min，藉以破坏还原型抗坏血酸。然后再中入2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液释稀至刻度，混匀后过滤，取这种滤液10mL用2，6-DCIP进行滴定，记下消耗的DCIP溶液体积（mL）。（2）水果样品&&&&43&&&&&&&&将新鲜水果去皮，可食部分切成小块，称取25—50g样品置于匀浆器中或研钵内，加入25mL2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液研磨，抽提液倾入100mL容量瓶中，残渣再加25mL2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液研磨和抽提两次，每次抽提液均倾入容量瓶中，最后用2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液定容至100mL。混匀后用快速滤纸过滤（最初数mL滤液弃去）或离心，取滤液或上清液10mL放入50mL锥形瓶内，随即用2，6-DCIP溶液快速滴定至终点，取10mL2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液作空白对照滴定，样品液和空白对照的各平行做3份。（3）蔬菜样品称取新鲜蔬菜100-200g，洗净后淋干并用纱布拭去其表面水份，切成碎块置于组织捣碎器内，加入100mL2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液，捣碎1—2min。称取匀将20—50g倾入100mL容量瓶中，用2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液洗涤匀浆容器数次，洗液均转入容量瓶中，最后稀释至刻度。混匀后用快速滤纸过滤（或离心），弃去最初滤出的滤液。如果样品颜色太深，可采用白陶土进行脱色处理。吸取滤液5—10mL放入锥形瓶中，立即用标定过的2，6-DCIP溶液进行快速滴定。同时用2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液作空白对照，分别记下各次滴定所消耗的染料溶液的体积（mL）。（4）松针样品称取松针1g用水洗净，淋干并用滤纸吸去表面水分，放在研钵中，加入适量1%HCl溶液，充分研磨，静置后将上层抽提液倾入100mL容量瓶中。如此反复研磨抽提2—3次，最后用1%HCl溶液稀释定容至刻度。混匀后过滤或离心，取滤液5mL放入锥形瓶中，随即用2，6-DCIP溶液滴定。另取5mL1%HCl溶液作出空白对照滴定。（5）生物体液样品生物体液中维生素C的含量测定应采用新鲜样品，分析前必须制备成无蛋白质样品。向离心管中先加入4mL血清（血浆、尿液等），再加入6mL2%草酸（或4%偏磷酸-醋酸）溶液，充分混匀，离心（3500rpm）10min。取上清液8—9mL放入锥形瓶内，可直接用2，6-DCIP标准溶液进行滴定。样品和空白对照至少平行各做3份，取其平均值。尿液样品在滴定前还必须用PCMB处理，即取9mL无蛋白上清液放入离心管中，再加1mLPCMB溶液（2mg·mL-1），混匀后放置5—10min。然后离心10min，取上清液8—9mL放入锥形瓶内，用2，4-DCIP溶液滴定之。注意：各样品滴定过程宜迅速，一般不超过2分钟。滴定所用的染料不应少于1mL或多于4mL，如果样品含抗坏血酸太高或太低时，可酌量增减样液。2、2，6二氯酚靛酚溶液的标定准确吸取标准抗坏血酸溶液1.0mL（含0.1mg抗坏血酸）置100mL锥形瓶中，加9mL1%&&&&44&&&&&&&&草酸，用微量滴定管以稀释10倍的2，6-二氯酚靛酚滴定至淡红色，并保持15秒钟不褪色即为终点。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少mg抗坏血酸。&&&&四、结果与讨论&&&&计算：抗坏血酸（mg/100g样品）=&&&&(VA?VB)?T?100W&&&&T=1mL染料能氧化抗坏血酸mg数。W=10mL样液相当于含样品之g数。VA为滴定样品时所消耗的染料mL数（平均值）；VB为滴定空白时所有消耗染料的mL数。讨论：本法测定VC的利与弊。注：①2%草酸可抑制抗坏血酸氧化酶，1%草酸因浓度低不能完成上述作用。偏磷酸有同样功效。若样品中含有大量Fe2+可用8%醋酸溶液提取，如仍用偏磷酸或草酸为提取剂，Fe2+可以还原二氯酚靛酚，如用醋酸则Fe2+不会很快与染料起作用。故可用4%偏磷酸-醋酸液代替25草酸液。②如浆状物泡沫很多，可加数滴辛醇或丁醇。③若浆状物不易过滤，可离心取上清液测定。④如滤液颜色太深，滴定时不易辨别终点，可先用白陶土脱色。⑤样品中某些杂质亦能还原二氯酚靛酚，但速度均较抗坏血酸慢，故终点以淡红色存在15秒钟为准。&&&&五、思考题&&&&1．提取VC时，加入2%草或4%偏磷酸-醋酸液的作用是什么？2．如果提取液颜色太深而又无法脱尽，严重影响滴定终点判断时，是否有其它办法能准确判断出终点？（提示：借助仪器）3．提取液中的抗坏血酸氧化酶是否会影响本实验结果？能否加热消除该酶的影响？&&&&45&&&&&&&&方法二碘量法&&&&一、原理&&&&维生素C包括氧化型、还原型和二酮古乐糖酸三种。当用碘滴定维生素C时，所滴定的碘被维生素C还原为碘离子。随着滴定过程中维生素C全被氧化，所滴入的碘将以碘分子形式出现。碘分子可以使含指示剂（淀粉）的溶液产生蓝色，即为滴定终点。本法测定的是还原型维生素C的含量。&&&&二、材料、试剂与器材&&&&1、材料：猕猴桃2、试剂：（1）2%草酸：称取10g草酸，用蒸馏水定容到500mL。（2）2%淀粉溶液：称取10g淀粉，用蒸馏水定容到500mL。（3）0.02M的I2-KI溶液：称取3.32g碘化钾溶于5mL蒸馏水中，再加2.5g碘。待碘完全溶解后，加蒸馏水995mL，混合均匀后贮于棕色瓶内。（4）5mg/mL的维生素C：称取2.5g维生素C用蒸馏水定容到至500mL。&&&&三、操作方法&&&&（1）样品处理水果（猕猴桃）称量后去皮，加入一倍体积2%草酸匀浆1min，用纱布过滤，滤液定容至一定体积。（2）滴定a标准维生素C溶液（5mg/mL）的测定取2mLVc溶液于锥形瓶中，加入1mL淀粉液，用碘液滴定至蓝色出现（30秒中内不褪色），记下碘液体积V标准。b样品维生素C的测定取上述猕猴桃液10mL锥形瓶中，加入1mL淀粉液，用碘液滴定至蓝色出现（30秒中内不褪色），记下碘液体积V样品。（3）计算10mg/V标准=M样品（mg）/V样品&&&&根据猕猴桃重量及滤液体积计算每100g猕猴桃中的VC含量。&&&&四、注意事项&&&&（1）看到红棕色出现时要放慢滴定的速度。（2）以显蓝色在30s内不褪色为滴定终点。&&&&46&&&&&&&&实验九酪蛋白的制备&&&&一、目的要求&&&&学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。&&&&二、实验原理&&&&牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成分。蛋白质中的酪蛋白通过等电点沉淀，再通过离心而获得，糖类小分子由于处于清液中而分离，沉淀物中所舍的脂肪通过有机溶剂抽提而去除，最终得到纯白色、晶状酪蛋白。&&&&三、试剂与器材&&&&试剂：0.2mol/LHAc-NaAc缓冲液、95%乙醇、乙醚器材：离心机、水浴锅&&&&四、操作方法&&&&1、取l0mL40℃牛奶预热，加入40℃预热的醋酸缓冲液10mL，边加边搅拌，室温冷却，5000r/min离心5min，得到沉淀。2、于离心管内加入4mLH2O悬浮沉淀，5000r/min离心5min，再次得到沉淀。3、于离心管内加入20mL乙醇，放置5min，轻微搅动，去沉淀中的脂肪成份。4、上述悬浮液5000r/min离心5min，弃上清。加入20mL乙醇重新悬浮沉淀，5000r/min离心5min，弃上清。后加入20mL乙醇乙醚混合液（1：1）进行洗涤，5000r/min离心5min，后再加入20mL乙醚洗涤沉淀，离心，弃上清。5、所得沉淀于60℃烘箱中烘干4h，称重并计算得率。&&&&五、计算&&&&实际获得百分率=酪蛋白质量（g）/l0mL牛奶?l00%&&&&六、注意事项&&&&1、独自实验，认真、规范地操作。2、牛奶与缓冲液要预热。3、加入缓冲液时应缓加缓搅。4、敞开门窗，保持实验环境空气流通。&&&&47&&&&&&&&实验十高铁-硫酸显色测定血清胆固醇&&&&一、目的要求&&&&1、学习血清总胆固醇的测定方法及临床价值。2、巩固分光光度测定法的原理和操作。&&&&二、实验原理&&&&用异丙醇沉淀血清蛋白质，提取上清液中的胆固醇，再用氧化铝吸附红素、磷脂、甘油等干扰物，离心后于上清液中加入高铁-硫酸试剂，反应产物显紫色，其显色程度与血清总胆固醇（TotalCholesterol，TC）浓度成正比。&&&&三、材料、试剂与仪器&&&&1、材料：动物（兔）血清。2、试剂：（1）异丙醇（AR）。（2）氧化铝层析用中性氧化铝以蒸馏水清洗数次，除去上浮细颗粒，吸滤抽干，于110℃烘箱中干燥4h，贮存于干燥器或密闭容器中备用。（3）3.7mmol/l。三氯化铁贮存液准确称取FeC13-6H200.1g，溶于lOOml冰醋酸，可长期保存。（4）显色剂将上述三氯化铁贮存液与浓硫酸以1：1(V/V)的比例混合，室温放置。（5）5．17mmol/L(200mg/dl)胆固醇标准液精确称取胆固醇200mg，用异丙醇配100ml溶液，分装后4℃保存，临用时取出。也可用定值血清作标准。3、仪器：分光光度计&&&&四、实验步骤&&&&1、提取纯化分别吸取血清和标准液（或定值血清）各200?l，加至带塞的离心管，再向离心管底部加入异丙醇5ml，使蛋白质沉淀成细小颗粒，然后各管中分别加入氧化铝1g，于振荡器上混合10min，最后2000r/min离心10min。2、显色分别取上清液各1ml，加入到相应的测定管和标准管，空白管中加异丙醇1ml，于56℃水浴5min，再分别沿管壁加入显色剂3ml，充分混匀后，继续水浴保温25min，冷却至室温后比色。3、分光光度计比色测定，在540nm波长处，以空白管调零，读取各管吸光度。&&&&五、计算&&&&血清TC（mmoL/L）=&&&&测定管吸光度?胆固醇标准浓度标准管吸光度&&&&48&&&&&&&&六、参考值&&&&血清正常上限值：5.20mmol/L；危险阈值：5.20—6.20mmol/L;高胆固醇血症：≥6.20mmol/L。&&&&七、注意事项&&&&1、抽提液与显色剂混合时会产生大量的热，其产热程度将影响显色反应，所以操时应注意：（1）测定同一批标本时选用型号一致的试管，口径的试管便于快速混合。（2）加入显色剂时，应使之与异丙醇分为两层，然后迅速混合，使完显色。（3）显色剂要逐管加入并快速混合，不可成批完成。2、反应中所用试管和比色杯等应清洁干燥。3、防止浓硫酸吸水影响检测结果。&&&&八、临床意义&&&&1、TC增高常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症（如家族性高胆固醇血症、家性ApoB缺陷症、多源性高胆固醇血症、混合性高脂蛋白血症等）、糖尿病、肾病综合征、总胆管阻塞、甲状腺功能减退、肥大性骨关节炎、老年性白内障和牛皮癣。2、TC降低常见于低脂蛋白血症、贫血、败血症、甲状腺功能亢进、?肝脏疾病、严重感染、营养不良、肠道吸收不良和药物治疗过程中的溶血性黄疸及慢性消耗性疾病，如癌症晚期等。&&&&49&&&&&&&&实验十一血红蛋白的提取和分离&&&&一、目的要求&&&&1、学习蛋白质制备的基本原理和方法2、学习和掌握从血液中提取、制备血红蛋白的一般方法&&&&二、实验原理&&&&血红蛋白是生物界分布最广的一种蛋白质,普遍存在于脊椎动物的红细胞中。在人的红细胞中的浓度为34%,占红细胞总蛋自量的90%,每一个红细胞约含2.8?109个血红蛋白分子。血红蛋白的提取常用冻融溶血法和一般提取法。冻融法费时较长，需使用特殊缓冲介质，但能完整保留各类血红蛋白，适于科学研究或临床检验、鉴定所采用。一般提取法简便快速，适于一般实验和工业制备。本实验采用一般提取法进行血红蛋白的提取。血液先用柠檬酸钠抗凝，后用生理盐水洗涤红细胞以除去血浆蛋白和白细胞。洗净的红细胞以甲苯-水介质溶血，释放血红蛋白。通过离心、过滤、分液等分离操作分出血红蛋白，通过透析法去除小分子，进一步纯化血红蛋白粗品。&&&&三、材料、试剂与仪器&&&&1、材料：新鲜脊椎动物血液（鸭血，抗凝处理）；透析袋。2、试剂：柠檬酸钠，抗凝用，100mL血液加入3.0g柠檬酸钠。生理盐水：质量分数为0.9%的NaCl溶液，即9.0gNaCl配成1L的溶液。3、仪器：离心机、磁力搅拌器。&&&&四、实验步骤&&&&1、红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤地分离和纯化。采集的血样（每组取抗凝血10ml）须及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心（1500r/min离心3min）。然后用吸管吸出上层透明的黄色血浆。将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，加入五倍体积的生理盐水，缓慢手动匀速搅拌数分钟，使溶液体系混匀，低速短时间离心。如此重复洗涤三次，直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。2、血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水至原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌（搅拌器上最大的转速）10min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。3、分离血红蛋白溶液将上述混合液移至15mL塑料离心管中，5000r/min离心10min，注意观察溶液的分层情&&&&50&&&&&&&&况：可观察到试管中的溶液分为四层（图）。从上往下，第一层无色透明，为甲苯层；第二层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层；第三层为红色透明液体，为血红蛋白溶液，直接用滴管取该层的液体；第四层为其他杂质的暗红色沉淀物。对离心管中的溶液进行过滤，除去沉淀物，滤液与分液漏斗中静置，分出下层的红色透明液体。4、透析每组取3mL的血红蛋白溶液进行透析。血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH7.0），透析12h。&&&&五、注意事项&&&&1、观察所处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能较好除去血浆蛋白的原因。2、离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。&&&&51&&&&&&&&实验十二凝胶柱色谱纯化血红蛋白&&&&一、目的要求&&&&1、学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。2、通过凝胶过滤柱层析对血红蛋白进行纯化&&&&二、实验原理&&&&该法又称为分子排阻色谱（molecularexclusionchromatography），分子筛色谱（molecularsievechromatography）。它所用的载体为一定孔径的多孔性亲水性凝胶。这种凝胶具有网状结构，其交联度或网孔大小决定了凝胶的分级范围。当把这种凝胶装入一根细的玻璃管中，使不同蛋白质的混合溶液从柱顶流下，由于网孔大小的影响，对不同大小的蛋白质分子将产生不同的排阻现象。比网孔大的蛋白质分子不能进入网孔内而被排阻在凝胶颗粒周围，先随着溶液往下流动；比网孔小的程度不同，因此流出的速度不同，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到分离目的（图12.1）。&&&&在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积称为外水体积V。不能进入凝胶孔径的那样大分子，当洗脱体积为V。时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi，能全部进入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。+Vi时出现洗脱峰，介于其间的分子将在洗脱体积为V。+Ve时，出现洗脱峰（图12.2）。&&&&52&&&&&&&&三、凝胶的种类&&&&用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酸胺和琼脂糖。1．交联葡聚糖凝胶：交联葡聚糖商品名为Sephadex，它的原料是细菌分泌的链状葡聚糖。通过交联剂交联而成。交联剂添加越多，孔径越小，吸水量也就越小；反之越大。商品Sephadex以G值表示不同交联度，G值越大，空穴也越大，G后边的数字表示每克干胶膨时吸水量的10倍，G-25表示每克干胶可吸附2.5g水。2．聚丙烯酸胺凝胶：聚丙烯酸胺凝胶是丙烯酸胺和N，N‘一次甲基二丙烯酸胺聚合而成。这种凝胶的商品名为Bio—gelP。其孔穴大小也是随交联增多而减少，并用P值表示不同的交联度，P值越大，孔径也越大。3．琼脂糖凝胶：琼脂糖是从海藻琼脂中分离除去琼脂胶后的中性级分。它是D一半乳糖和脱水L一半乳糖相间重复结合而成的链状化合物。琼脂糖的商品名为Sepharose或Bio—gel。琼脂糖凝胶，其机械强度都比葡聚糖凝和聚丙烯酸胺凝胶好得多，同时它对生物大分子等高分子的吸附作用也小得多。另外，琼脂糖凝胶适用相对分子质量的范围宽，最大可以到108，这一点是另外两种凝胶所无法达到的。4．Sephacryl凝胶：Sephacryl是由丙烯基葡聚糖和N，N‘一甲叉双丙烯酸胺共介交联而成的硬凝胶。其类型有Sephacryl—100，S—200，S—300，S—400和S—500几种，它们都是超细颗粒。Sephacryl在常用溶剂（除化学去垢剂外）中不溶解，稳定性很高。5．Superdex凝胶：Superdex是最新的凝胶填料，它是将葡聚糖以共价方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。琼脂糖的高交联骨架为珠体提供了较高的物理化学性质，葡聚糖为介质提供了优良的选择性。这类凝胶物理化学性质稳定，刚度强，适合于高流&&&&53&&&&&&&&速，且分辨率高。&&&&四、凝胶柱层析的使用方法&&&&1．凝胶的选择（1）粒子的大小与孔径选择凝胶粒子必须分散均匀，能够较快的扩散以及有效地分离。&&&&高分子物质必须能够扩散到凝胶内才能起到分子筛的效应，不同型号的凝胶皆有各自的排阻极限。（2）凝胶必须是惰性的任何带电荷的凝胶，或对分离物质有亲和力者，都将干扰分离效果。2．色柱装置（图12.3）色谱柱的规格要根据分离样品的性质和目的来定。最常用的是内径2.5cm（2~4cm）。长度为100cm（40~100cm）的玻璃柱。&&&&3．凝胶的处理为了获得合适的流速和良好}