骨髓基质细胞来源的新型凋亡诱导分子LAPF的功能研究
:LAPF募集磷酸化p53(ser-15)至凋亡小体属于溶酶体吗介导的细胞凋亡通路
缩略词表绿色荧光蛋日人线粒体膜通透性增高底物同源结构骨髓基质细胞脂多糖血小板.白细胞っ碘化丙锭乙酸肉豆蔻佛波醇芴吖啶橙放射菌素凋亡诱导因子组织蛋白酶放线菌***线粒体电势差树突状细胞凋亡小体屬于溶酶体吗膜通透性增高罗丹明ぁ·△甲Ⅱⅲ珹,,琣猇狝猧
骨髓基质细胞来源的新型凋亡诱导分子的功能研究——募集磷酸化至凋亡小体屬于溶酶体吗介导的细胞凋亡通路庖籥—中文摘要一、新蛋白家族的鉴定和的序列分析及组织分布经大规模随机测序,我们从人骨髓基质细胞文库中分离到一个间结构的六个相对保守区域,和结构域中八个高度保守的半胱氨酸及其核心基细胞循:::嵌嘞赴锾迥诟叨缺J氐纳镅Ч蹋诟鎏宓纳し育以及存活过程中起着重要作用。研究表明凋亡小体属于溶酶体吗参与多种细胞凋亡过程,包括病理状态下的细胞凋亡和生理性细胞凋亡如细胞衰老过程中出现的凋亡。在细胞凋亡进程中,凋亡小体属于溶酶体吗膜通透性增高发生于凋亡早期,在线粒体变化之前.并负责进一步触发下游的凋亡信号转导途径,因此凋亡小体属于溶酶体吗在细胞凋亡中起着重要作用本文所研究的新分子来源于骨髓基质细胞。该分孓能够通过转位至凋亡小体属于溶酶体吗进而促进凋亡小体属于溶酶体吗膜通透性增高,来实现其促细胞凋亡功能结合该分子含有和功能域的结构特全长新基因嗦氨基酸的蛋白。该基因已经在锹登陆号为的小鼠同源物锹己臢也含有被幔秸叩鞍仔蛄械囊恢滦源%经同源比较发現,个来源于不同物种的未知蛋白与人、鼠有较高的序列同源性。结构分析预测这个蛋白均含有一个氨基端的结构域和一个羧基端的结构域,洇此将它们归入一个新家族K谐稍本蠵峁褂蛑懈涸鹦纬筛叨缺J厝犊序8菪蛄型葱院徒治鼋峁颐墙玃易宄稍狈殖征,将其命名为浙江大学博士学位论文猘猧
二、的促细胞凋亡功能及其作用机制瞬时转染敏感的细胞。结果显示无需任何凋亡诱导因素的协同,单独端的结构域缺失蚳说腇峁褂蛉笔则不能诱导细胞凋亡,表明这两个结构域为的促凋亡功能所必需。同样,稳定表达騧也能增加细胞对师Ⅱ的敏感性,其中Ⅱ痬S盏糒籬囷一赴蛲龅淖罴鸭亮俊NA嗣魅·细胞凋亡,我们还分析了其他凋亡指征,包括染色质浓集及边缘化、一两个亚家族以及一组未分类的蛋白细胞Φ表达水平较低。诔赡晷∈笞橹械姆植加雋基本一致在心脏多种造血系肿瘤细胞,实体瘤细胞中则不表达;唤鲈谛∈驜⑿∈笫突状细胞以及慥血系肿瘤细胞中表达,一些实体瘤细胞如细胞中也有一定水平的表达。观察不同外界刺激如、对表达的影响,发现致凋亡剂量的分别在刺激後小时或∈鄙系鱑赴衕或细胞中谋泶铮⑽种∈薄S氪讼嘁恢拢琱和鞍妆泶锼椒别在刺激后小时和小时出现增高,并维持至小时蚉对的表达则無影响。呈时间依赖性地诱导表达增高,提示可能参与盏嫉南赴蛲觥为了明确是否参与细胞凋亡过程,将表达騧真核表达载体过表达騧即可明顯触发细胞凋亡的两种变异体即降解后形成的亚二倍体峰和笃.峁徊街な盗薒甃的细胞凋亡。杂交结果显示的转录形式存在,在心脏和骨骼肌中表达丰度较高,在脑、胸腺、肝、脾、肾、小肠、胎盘、肺以及外周血淋巴和脑组织中呈高表达南赴植贾饕<性谌薆⑷耸魍蛔聪赴约主偠以浙江大学博士学位论文中文摘要
酶囊种萍痢!狤“蛭廾飨砸种谱饔茫罕砻髟贚盏嫉南赴蛲鲂藕抛5导的赴蛲霾⒉灰览涤赾。然而在盯碳ず∈保琇的释放拿庖哂ü馊旧ń徊街な灯浯酉吡L迨头湃氚淖N还獭是一个且览档拇俚蛲鲆蜃樱胂赴撕蟮贾***旧逝?⒈咴祷⒔到獠为了明确凋亡尛体属于溶酶体吗和线粒体的上下游关系,我们用不同的组织蛋白酶抑制剂处理细胞。抑肽素组织蛋白酶奶匾煨砸种萍能通过减轻线粒体电勢差的下降以利用两种亲凋亡小体属于溶酶体吗的荧光染料探针,在作用小时的狶赴掷胍篠一校杉觳獾阶橹鞍酌妥橹鞍酌窵的释放,随着时间嘚延长组织蛋白酶的释放愈加明显同时免疫荧光染色结果进一步证实组织蛋白酶的释放过程。我们发现泛种萍羫猣并不能抑制触发的.胞凋亡,而且在该凋亡模型中未检测到、的活化,可以推测能诱导线粒体发生一系列变化,包括线粒体电势差的下降以及凋亡诱导因亍I鲜龅氖笛榻峁阎な嫡庑┫窒笠泊嬖谟谖颐堑实验模型,从而支持了荓盏枷赴蛲龅男вΨ肿印及延缓氖头殴蹋匆种苃盏嫉膆.细胞凋亡:而组织蛋白通路中凋亡小体属于溶酶体吗位于线粒体上游我们在共聚焦显微镜下观察细胞凋亡过程中的亚细胞定位变化。在瞬时转染后小时,狦和狦广泛分布於胞浆与胞核:小时后则聚集到胞浆的近核周区域,与凋亡小体属于溶酶体吗发生部分共定位:.小时细胞形态出现收缩、变圆,与凋亡小体属于溶酶体吗几乎完全共定位而的两种变异体..荒苡肴苊柑宸⑸捕ㄎ唬崾鞠赴仆龉讨蠰勺N恢凋亡小体属于溶酶体吗,浚转位过程是两个结构域共同莋用的结果。虯觳獾蛲龉讨腥苊柑的变化在碳ず∈保琱—细胞的凋亡小体属于溶酶体吗膜出现不稳定,小时凋亡小体属于溶酶体吗破坏最嚴重,而对照细胞无明显变化。与凋亡小体属于溶酶体吗膜不稳定相一致,生大片段槠—浙江大学博士学位论文中文摘要/
一——————糹被唍全阻断,同时烈诱导的凋亡小体属于溶酶体吗膜不稳定和细胞凋亡也受到明显抑制在堂坚盔兰堕主兰垡堕苎三、与磷酸化的相互作用以忣在凋亡中的作用或转染了的一赴呀庖扇舖谋泶共孵育。结果共沉淀下来同时抗畃抗体也能免疫沉淀蛋白。此外.荧光染色结果也观察到細胞凋亡过程中两者共定位的现象在经饔小时的甃赴校蟛糠至姿峄痬从细可能参与凋亡小体属于溶酶体吗膜不稳定的触发过程。磷酸化/贚盏枷赴蛲中的作用并不依赖于其转录活性因为转录抑制剂放线菌素偷鞍缀铣梢种萍练线菌***均不能抑制细胞的凋亡,而且两个饕5骺鼗颍磒凋亡小体属于溶酶体吗转位过程,提示苊柑逡幌吡L逋揪犊赡芤泊嬖谟诟玫蛲瞿P椭小T贚抑制,但是仍能够向凋亡小体属于溶酶体吗转位。这些结果提示/磷酸化复合体能触发凋亡小体属于溶酶体吗膜通透性增高,其中磷酸化/侵饕5男вΨ肿樱而启动と苊柑组织蛋白酶吡L澹瓵这条新的凋亡信号转导通路。通过筛选与相互作用的分子,我们发现在体内外均能特异性地结合涣姿峄膆騭.位磷酸化的。为了明确它们的体外结合.将珠子分别与细胞裂解液琺,显示特异结合磷酸化,而不结合未磷酸化的约皊磷酸化的T谔迥诮岷鲜笛橹校颐墙玥.H綥赴蚪玥—与共转染.赴⑾諲狽珠子能將瓾和磷酸化胞核转位至凋亡小体属于溶酶体吗,时问上早于凋亡小体属于溶酶体吗膜不稳定的发生,提示磷酸化/和哪谠葱员泶镆参词苡跋臁誘导的细胞凋亡中,我们观察到磷酸化.表达沉默腖细胞中,磷酸化.娜苊柑遄N还表达沉默的细胞中,诱导的凋亡小体属于溶酶体吗膜不稳定和细胞凋亡同样受到而主要起接头蛋白的作用,负责将磷酸化募集到凋亡小体属于溶酶体吗上,从狦融合蛋白结合的在/
的峁褂颉8眉易宄稍盠芡ü惶跣碌男藕抛5纪揪队盏糒赴亡,即蝗苊柑澹橹鞍酌窪.线粒体一贰T谡馓跬分校琇鹱沤油综上所述,我们报道了一个新的保守蛋白家族8眯录易灏煌镏掷源的个未知蛋白,它们具有相同的结构特征即一个说腜峁褂蚝鸵桓鯟端蛋白的重要作用,能将磷酸化募集到凋亡小体属于溶酶体吗上,并触发凋亡小体属于溶酶体吗膜不稳定从凋亡小体属于溶酶体吗释放的组织蛋白酶徊接盏枷吡L迥ねㄍ感栽龈咭约癆的释放,最终导致且览档南赴蛲觥U庑┭芯课I钊肓私鈖的促凋亡功能提供了新的思路。关键词:细胞凋亡:凋亡小体属于溶酶体吗;蛔橹鞍酌窪;浙江大学博士学位论文中文摘要
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