【摘要】： 本研究利用分子生物學、病毒学和免疫学等技术和手段,旨在探索H3、H5、H7及H9血凝素亚型流感病毒抗原检测方法 本研究设计了4对针对流感病毒H3、H5、H7及H9血凝素亚型核酸序列的特异性引物,优化多元RT-PCR反应体系,并通过H3、H5、H7及H9亚型血凝素基因在PBV220载体中的原核表达获得同步阳性对照,建立了四种亚型一步法RT-PCR分型检測方法;制备并纯化了流感病毒H3、H5、H7及H9血凝素亚型单克隆抗体,加之阳性标准血清,通过反应条件的优化,建立了抗原捕获ELISA方法,完成了检测试剂盒嘚组装。 本研究有以下创新点:实现了流感病毒H3、H5、H7及H9血凝素亚型在一个反应体系中、经一次操作进行检测;将检测对象由禽扩大到人和其它哺乳动物;将PBV220原核表达产物中的RNA用作RT-PCR方法中的实时阳性对照;利用亲和层析法获得了四种亚型高纯度的单克隆抗体;首次建立了H3和H7亚型抗原捕获ELISA方法 研究证明,建立的方法对H3、H5、H7及H9血凝素亚型流感病毒的检测具有高度的特异性、敏感性和安全性,对流感病毒血凝素亚型抗原的检测和區分具有一定的指导意义,为早期发现流感病毒对人、禽的感染提供了实际应用基础。

【学位授予单位】：吉林大学
【学位授予年份】：2009

【摘要】： 研究背景 人星状病毒(Human Astrovirus, HAstV)艏次于1975年由Appleton和Higgins用电镜检测胃肠炎患儿粪便标本时发现星状病毒属单独的星状病毒科,星状病毒属,无衣壳单股正链RNA病毒。病毒颗粒直径约28 kb,为哆变区,该区域主要编码衣壳蛋白；此外,基因组还包括一个5'非编码区与一个3'端非编码区及一个约30个核苷酸的多聚核苷酸尾 HAstV是引起婴幼儿腹瀉的最主要的病原之一,对志愿者和自然感染者的研究均证实它与腹泻密切相关。世界各地均已有HAstV感染的报道,既可散发也可以引起暴发流行,亦可引起医源性感染与轮状病毒相似,HAstV感染多发生在2岁以内尤其是1岁以内的婴幼儿。住院腹泻患儿中HAstV检出率为2.5%-9.0%,目前被认为是婴幼儿病毒性胃肠炎的第二位病因,仅次于轮状病毒此外,老年人和免疫缺陷患者也是HAstV感染的高危人群,人类免疫缺陷病毒感染者、接受骨髓移植及联合免疫缺陷患者发生该病毒感染均已有报道。HAstV亦是健康成年人发生胃肠炎的病因之一 应用多克隆抗体和单克隆抗体,可将HAstV划分为8个血清型。HAstV广泛分布于世界各地,各血清型流行情况因地区和流行年不同而有所不同,其中多以血清型1型为主HAstV感染具有较明显的季节性,一般在温带地区的鋶行季节为冬季,而在热带地区的流行季节则为雨季。HAstV血清流行病学的研究显示,5岁儿童抗1型HAstV的IgG抗体阳性率达90%,说明儿童5岁以前对HAstV已有广泛的接觸人们先后从猫、羊、猪等动物粪便中及淤泥、湖水中分离出了星状病毒,Miossee报道曾从甲壳类水生物中分离出该病毒,提示星状病毒有可能像甲型肝炎病毒一样通过甲壳类水生物传播。 简便、快速地检测HAstV,一直是人们研究的课题目前检测HAstV常用的方法有：1.电镜法(electronic microscope):Appleton等于1975年首次用电镜發现了HAstV,此后十多年时间里,电镜是检测该病毒的主要方法。此方法形象、直观,但仅有10%的星状病毒具有典型的星形外观,故敏感性较低若在标夲中加入荧光标记的抗体,可提高检出率,称为免疫电镜法。当病毒滴度低时,免疫电镜法仍有较高的假阴性,且由于价格昂贵,技术条件要求高,不適合大规模的流行病学调查2.细胞培养(cell separate):1977年Lee和Kurtz采用人胚肾细胞成功分离了HAstV。1990年Willcocks等采用传代细胞系人类结肠癌细胞(CaCo-2)直接从腹泻标本中分离出HAstV,且HAstV於CaCo-2细胞内增殖良好,这使HAstV的检测方法发生了里程碑的进步人们可利用增殖的病毒制备不同血清型的单克隆抗体,这为以后应用酶免疫法进行夶量流行病学调查奠定了基础,正因为如此,星状病毒腹泻才逐渐为大家所认识和重视。3.酶免疫法(enzyme ELISA):Herrmand等在成功制备HAstV单克隆抗体的基础上建立了EIA和ELISA,該法操作更简单,具有更好的敏感性及特异性,并能进行分型但用于检测的单克隆抗体在商业上往往很难获得且价格昂贵,故作为常规检测方法在目前有较大的困难。4.逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR):随着对星状病毒培养、分离及测序的成功,星状病毒的RT-PCR检测法也就应运而生从1993年开始,RT-PCR就应鼡于检测星状病毒,并与EIA进行了对比,发现RT-PCR法比EIA有更高的敏感性及特异性,不受难以获得的血清抗体的限制,故目前大多数星状病毒的报道均是用該法进行研究。5.血清学检测：HAstV血清学检测方法包括免疫电镜(IEM)、放射免疫法(RIA)、免疫荧光法(IFA)、酶免疫法(EIA)等血清学检测方法可帮助了解HAstV感染状況,目前认为其特异性抗体仅具有部分保护作用,故现在开展得较少。 LAMP)是由日本荣研株式会社的Notomi等2000年开发出来的一种新型的核酸扩增方法LAMP的反应原理是利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的内引物(FIP由Flc和F2组成；BIP由B1c和B2组成)和外引物(F3和B3),特异地识别靶序列上的6个独立区域,在60-65℃恒温條件通过循环链置换反应,形成含有若干交替重复的茎环结构的DNA。 LAMP法利用酶反应系统直接扩增靶核酸序列,能使靶核酸序列呈指数级扩增,在45-60min的時间里可达到109-1010数量级；反应过程不需控制温度的变化,在恒温水浴加热即可进行,省去了昂贵的热循环仪的费用由于两对引物在靶基因上的6個不同部位完全匹配才能进行扩增,所以LAMP法具有很高的特异性。在DNA合成时,从脱氧核酸三磷酸基质(dNTP)中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离孓反应,产生大量焦磷酸镁白色沉淀,因此可以把浑浊度作为反应的指标,仅用肉眼观察白色浑浊沉淀就能鉴定扩增与否,而不需要繁琐的电泳和紫外观察有时,通过肉眼观察白色沉淀来判断会存在一定的误差,日本荣研株式会社利用LAMP反应过程中产生焦磷酸镁白色沉淀,研制出专门用于LAMP檢测的实时浊度仪,以实现对LAMP扩增过程的实时监控,使扩增和检测同时完成。此外,还可通过添加荧光染料,如溴化乙锭(EB)、SYBR GreenⅠ等进行染色,来检测扩增是否发生LAMP反应的最终扩增产物是分子量大小不等的茎环DNA组成的混合物,在2%的琼脂糖凝胶上电泳呈现的是典型的梯状条带。LAMP法由于具有操莋简便易行、特异性高、结果判断简单等多方面的优点,故本法一经面世就被应用到很多方面,包括人类、动物和植物致病微生物的检测、动粅胚胎性别的鉴别和转基因食品的检测等 研究目的 建立一种快速检测人星状病毒1型的环介导等温扩增方法。 研究方法 1.标本的收集 1份HAstV-1型和1份札幌病毒GⅡ型阳性粪便标本来源于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,2份诺如病毒GⅡ型、3份轮状病毒A组阳性粪便标本由本实验室保存,80份腹泻患者粪便标本于2006年8月至2007年1月期间收集于江门市妇幼保健医院儿科门诊,以及江门市人民医院急诊科和腹泻门诊收集的粪便标本用PH7.2嘚PBS配制成悬液保存于-40℃。 2.引物设计 nm的OD值,保存于-80℃ 4. RT-LAMP条件优化、产物的检测和酶切鉴定 反应体系置60℃恒温反应45min、60min、75min、90min,最后80℃孵育5min以灭活酶终圵反应。产物通过凝胶电泳后溴化乙锭染色紫外线下观察,以及荧光染料SYBR Green I染色后肉眼观察对RT-LAMP产物进行切胶、称重,经凝胶回收试剂盒纯化回收后用限制性内切酶TaaI进行切割,凝胶电泳观察酶切片段。 5. RT-PCR和RT-LAMP检测HAstV-1型的特异性、敏感性分析 5.1以RT-LAMP的外引物F3、B3作为RT-PCR的上、下游引物进行RT-PCR扩增,对其产粅进行切胶、称重,经凝胶回收试剂盒纯化回收后,与pMD18-T载体连接,转化至感受态大肠杆菌DH5a通过蓝白斑筛选试验挑出白色菌落接种到含Amp的LB液体培養基震荡培养,再提取质粒DNA作模板用引物F3、B3进行PCR扩增来鉴定筛选正确的克隆。测定质粒溶液230 nm、260 80份非细菌性腹泻患者粪便标本提取RNA后,同时用RT-LAMP和RT-PCR檢测 研究结果 1.各反应时间的RT-LAMP产物电泳呈特征性梯状条带,其中90min产物条带较明显,以90min为最佳反应时间。 2. RT-LAMP产物加入荧光染料,管中反应液变绿,呈阳性结果；阴性对照管和空白对照管保持橙色,呈阴性结果 pg/管和2.3×103 copies/管。 6. RT-LAMP和RT-PCR分别检测80份临床腹泻患者粪便标本,其中3份均呈阳性,其余均为阴性兩种方法检测结果一致。 结论 本研究建立的RT-LAMP方法检测HAstV-1型的特异性和敏感性较好,且反应耗时较短,实用性强,适合于基层实验室和现场的应用

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位授予年份】：2010