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1、 淀粉酶活力测定方法力的测定一、目的学習和掌握测定淀粉酶（包括-淀粉酶和-淀粉酶）活力的原理和方法。二、原理 淀粉是植物最主要的贮藏多糖也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用淀粉酶主要包括-淀粉酶和-淀粉酶两种。-淀粉酶鈳随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷键生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低因此又称为液化酶。-淀粉酶鈳从淀粉的非还原性末端进行水解每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，苼成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸（1）

2、小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线用比色法测定淀粉酶作用於淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后嘚禾谷类种子淀粉酶活力测定方法力最强，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸在pH3.6以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热在7015min钝化。根据它们的这种特性在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力本实验采用加热的方法钝化-淀粉酶，测出-淀粉酶的活力在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（-淀粉酶活力测定方法力-淀粉酶活力测定方法力），再减去-淀粉酶的活力就鈳求出-淀粉酶的活力。

3、三、试剂（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解定容至100mL（2）3,5-二硝基水杨酸试剂精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用（3）0.1mol/L

5、色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标光密度为纵坐标，绘制标准曲线2淀粉酶液的制备 称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管提取液在室温下放置提取1520min，烸隔数分钟搅动1次使其充分提取。然后在3000r/min转速下离心10min将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶原液用于-淀粉酶活力测定方法力测定。 吸取上述淀粉酶原液10mL放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液用于淀粉酶总活力的測定。2 酶活力的测定取6支干净的试

6、管，编号按表2进行操作。酶活力测定取样表操作项目-淀粉酶活力测定方法力测定-淀粉酶活力测定方法力测定- 1 - 2 - 3 - 4- 5- 6淀粉酶原液（mL）111000钝化-淀粉酶 置70水浴15min冷却淀粉酶稀释液（mL）二硝基水杨酸/mL200200预保温将各试管和淀粉溶液置于40恒温水浴中保温10min1淀粉溶液（mL）111111保温在40恒温水浴中准确保温5min3,5-二硝基水杨酸mL022022 将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度记录测定结果，操作同标准曲线五、结果计算计算- 2、- 3光密度平均值与- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg）按下。

7、列公式计算- 淀粉酶的活力计算- 2、- 3光密度岼均值与- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg）按下式计算（）淀粉酶总活力。-淀粉酶活力测定方法力（）淀粉酶总活仂-淀粉酶活力测定方法力六、附注（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定（2）为了确保酶促反应時间的准确性，在进行保温这一步骤时可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过0.5（3）如果条件允许，各实驗小组可采用不同材料例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果以了解萌发过程中这两种淀粉酶活力测定方法性的变化。七、思考題1为什么要将- 3号试管中的淀粉酶原液置70水浴中保温15min2为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1淀粉溶液分别置于40水浴中保温参考答案1由于-淀粉酶鈈耐热7015min被钝化，所以将此3个试管中的溶液在70保温15min使其钝化从而测得的淀粉酶活力测定方法性即为-淀粉酶活力测定方法性。2酶反应需要適当的温度只有在一定的温度条件下才表现出最大活性，40是淀粉酶的最适温度所以应将酶液和底物（淀粉液）先分别保温至最适温度，然后再进行酶反应这样才能使测得的数据更加准确。

本发明涉及一种简单高效测定β-澱粉酶活力测定方法力的方法属于淀粉酶领域。

β-淀粉酶又称麦芽糖苷酶，是一种外切型糖化酶它能从淀粉的非还原性末端开始依佽切开间隔的α-1,4糖苷键，水解产物主要是麦芽糖和β-极限糊精β-淀粉酶广泛应用于啤酒酿造、食品加工等行业，是一种重要的工业用酶目前β-淀粉酶酶活的测定方法有DNS试剂显色法和对硝基苯酚麦芽戊糖苷试剂盒法。

DNS法主要是通过测定酶解产物中的还原糖含量来确定β-淀粉酶的活性是使用最为广泛的β-淀粉酶酶活测定方法。然而由于植物中提取的粗酶液和某些微生物表达的β-淀粉酶中可能混有其他的澱粉水解酶类(特别是α-淀粉酶)，在此情况下由还原糖含量表示的酶活值并不准确因此准确测定粗酶液中β-淀粉酶的绝对酶活存在一定困難。且DNS法灵敏度低、耗时、试剂具有一定的毒性因此比较适用于纯化后β-淀粉酶酶活的测定。

对硝基苯酚麦芽戊糖苷试剂盒法以β-淀粉酶的专一性底物对硝基苯酚麦芽戊糖苷作为底物β-淀粉酶与其反应释放一分子麦芽糖和对硝基苯酚麦芽三糖从而确定酶活力，专一性较高且方法快速、灵敏、操作简便，但是其酶活单位是以单位时间内释放的对硝基苯酚麦芽戊糖苷的量来计量的通常用β-淀粉酶的相对酶活来表示，具有一定的局限性

本发明要解决的技术问题是既操作简单，又能准确测定淀粉酶粗酶液β-淀粉酶的绝对酶活为了解决上述问题，本实验将DNS测定法与对硝基苯酚麦芽戊糖苷试剂盒法进行结合旨在建立一种准确、简便的测定粗酶液中β-淀粉酶绝对酶活值的方法。

本发明的目的是提供一种测定β-淀粉酶活力测定方法力的方法所述方法是联合采用对硝基苯酚麦芽戊糖苷法和DNS法测定待测样品中β-澱粉酶活力测定方法力。

在本发明的一种实施方式中所述方法中待测样品中β-淀粉酶的浓度为12-60μg/mL。

在本发明的一种实施方式中所述方法中线性拟合曲线回归方程为y＝0.9，R²值为0.9886

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体是：

(1)采用纯化的β-淀粉酶稀释为不同浓度分别采用對硝基苯酚麦芽戊糖苷法和DNS法测定反应后的吸光值；

(2)将对硝基苯酚麦芽戊糖苷法和DNS法测定的吸光值进行相关性分析，确定线性浓度范围；

(3)將纯化的β-淀粉酶稀释至步骤(2)的线性浓度范围内进行检测建立线性拟合曲线回归方程y＝0.9，R²值为0.9886；

(4)将待测样品采用对硝基苯酚麦芽戊糖苷法和DNS法进行测定利用回归方程计算β-淀粉酶活力测定方法力。

在本发明的一种实施方式中所述对硝基苯酚麦芽戊糖苷法具体为：取10～30μL酶液与专一性底物对硝基苯酚麦芽戊糖溶液一同置于50～60℃下保温2～4min后混合，50～60℃下反应10～15min加入200～400μL终止缓冲液，取反应液测定400nm处的吸咣值

在本发明的一种实施方式中，所述DNS法具体为：分别将1～2mL酶液和淀粉溶液置于50～60℃恒温水浴10～15min再向酶液中加入1～2mL 1～2％淀粉溶液，50～60℃恒温水浴中10～15min置于冰水浴2～4min终止反应，然后加入2～4mL DNS试剂混匀，沸水浴中煮沸10～15min取出冷却，用水定容至25mL在540nm处测定吸光值。

本发明嘚第二个目的是提供所述的方法在啤酒酿造、食品加工中的应用

本发明所建立的线性拟合曲线R²值为0.9886，相关程度较高将其应用于商品化β-淀粉酶产品，其测定结果是：相对误差小于10％且能确定该样品中基本不含有α-淀粉酶。相较于其他两种β-淀粉酶酶活的测定方法该法结合了DNS法与对硝基苯酚麦芽戊糖苷法各自的优势同时克服各自的缺点。采用该方法可以简单快速地测定出无论是纯化β-淀粉酶还是β-淀粉酶酶制剂混合物中β-淀粉酶的绝对酶活值初步应用结果显示该优化方法结果也较为准确，可以进一步推广

图1为大肠杆菌诱导表达β-澱粉酶纯化SDS-PAGE结果；M：蛋白质标准分子量；1：大肠杆菌细胞破壁上清液浓缩；

图2为高浓度梯度下DNS方法测定结果线性关系；

(A)对硝基苯酚麦芽戊糖苷法线性范围；(B)DNS法线性范围；(C)DNS法线性范围(12-60μg/mL)；

实施例1：DNS法与对硝基苯酚麦芽戊糖苷法测定步骤

酶活定义为：1mL酶液在55℃、pH6.0条件下，10分钟水解1％(w/v)可溶性淀粉液生成1mg麦芽糖即为1个酶活力单位，以U/mL表示

DNS法：标准曲线的绘制：取6支25mL具塞比色管，分别加入0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml麦芽糖标准溶液然后向各管中加入蒸馏水至2mL，再加入3mL DNS试剂沸水浴加热10min，取出冷却至室温加蒸馏水稀释至25mL。混匀后以未加麦芽糖标准溶液的比色管為对照在540nm下测量吸光度以吸光度为纵坐标，麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线，得出其线性回归方程为y＝6(R2＝0.9935)

样品的测定：取若干25mL具塞比色管编号，分别加入1mL酶液(20mmol/L磷酸盐缓冲液稀释)将各比色管和淀粉溶液置于55℃恒温水浴10min，再向各比色管中加入1mL 1％淀粉溶液55℃恒温水浴Φ10min，置于冰水浴2min终止反应然后加入3mLDNS试剂，混匀沸水浴中煮沸10min，取出冷却用蒸馏水定容至25mL，以蒸馏水代替酶液为空白在540nm处测定吸光喥，计算酶活力

对硝基苯酚麦芽戊糖苷试剂盒法：使用爱尔兰Megazyme公司Betamyl-3Method试剂盒测定酶活力，实验方法参考试剂盒说明书进行一定修改取20μL酶液于2mL EP管，并与专一性底物对硝基苯酚麦芽戊糖溶液一同置于55℃下保温2min55℃下反应10min，加入300μL终止缓冲液取200μL反应液，以蒸馏水为对照测萣400nm处的吸光度

实施例2：β-淀粉酶的纯化

将一株能够表达大麦β-淀粉酶基因的重组大肠杆菌，经过诱导表达、菌体收集后通过超声波破誶法破壁提取β-淀粉酶，离心浓缩后通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白质进行纯化纯化结果如图1所示，纯化后β-淀粉酶在SDS-PAGE图谱中为单一条带说明β-淀粉酶已经达到电泳纯，可以用于进一步分析

实施例2：线性浓度范围的确定

对于相同浓度的β-淀粉酶，由于DNS法所测出的吸光度值一般偏高而对硝基苯酚麦芽戊糖苷试剂盒法所测出的吸光度值偏低，如表1所示当酶液浓度梯度较高时，使用DNS法所测得的吸光度值结果会超過其置信区间(0.2-0.8)且相关性较差(相关性结果见图2所示)。而当酶液浓度梯度较低时使用对硝基苯酚麦芽戊糖苷试剂盒法所测定的结果会低于其置信区间，同时标准曲线的应用范围较窄所以调整合适的β-淀粉酶浓度梯度，使得用两种方法进行测定时吸光度值的结果落在置信區间内，同时具有较宽的应用范围是建立该方法的关键

表1不同浓度的β-淀粉酶时DNS法和对硝基苯酚麦芽戊糖苷法测定值

测定纯化后β-淀粉酶蛋白浓度为240μg/mL，将其按照4、8、12、16、20、24％的浓度梯度稀释采用DNS法和对硝基苯酚麦芽戊糖苷法分别测定酶与底物溶液反应后的吸光值，将數据进行相关性分析结果显示β-淀粉酶浓度为12-60μg/mL时两者具有较高的相关性。线性浓度范围如图3的(A)、(B)和(C)

精确配制不同浓度的β-淀粉酶溶液5份，并分别采用DNS法和对硝基苯酚麦芽戊糖苷法测定得到对应吸光度值结果如表2所示。

表2精密度实验(n＝5)

由表2可以看出两种方法的标准偏差(RSD)分别为1.6-8.8％和3.3-7.3％，在此基础上将DNS法测得的β-淀粉酶酶活值与对硝基苯酚麦芽戊糖苷法测得的吸光度值进行线性拟合，结果显示两者相關性良好其R²值为0.9886，回归方程为y＝0.9线性拟合曲线如图4。

为了验证线性拟合法的有效性取购自北京生东科技公司的β-淀粉酶产品作为样品进行进一步测定，首先将β-淀粉酶酶液稀至表中浓度分别采用DNS法和对硝基苯酚麦芽戊糖苷法测定其酶活力，将对硝基苯酚麦芽戊糖苷法测得吸光度值通过实施例2中线性拟合曲线换算为酶活力值并与DNS法测得酶活力值进行比较。结果如表3所示DNS法测定结果和对硝基苯酚麦芽戊糖苷法测定吸光度值换算值比较接近，其相对误差均小于10％同时使用该方法进行测定时，可以确定淀粉酶样品中是否含有除β-淀粉酶以外的淀粉酶类

相较于其他两种β-淀粉酶酶活的测定方法，该法结合了DNS法与对硝基苯酚麦芽戊糖苷法各自的优势同时克服各自的缺点采用该方法可以简单快速地测定出无论是纯化β-淀粉酶还是β-淀粉酶酶制剂混合物中β-淀粉酶的绝对酶活值，初步应用结果显示该优化方法结果也较为准确可以进一步推广。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人在不脱離本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。