胰蛋白酶、i型胶原酶酶、二甲基亞砜（DMSO）、丝裂霉素C（SigmaUSA）胎牛血清、淋巴细胞分离液。培养液（GibcoUSA）。倒置相差显微镜（Olympusjapan）。液体闪烁仪（BeckmanUSA）。新西兰大白兔（山東省农科院）3H-TDR（山东大学核医学研究所）。一抗：MOUSE ANTI RABBIT MHG CLASS I （Serotic

无菌切取新西兰大白兔胫骨骨膜切至1mm*1mm*1mm大小。0.25%胰蛋白酶消化20～30min0.1% I型i型胶原酶酶消化2h，至组织块成粘糊状大部分有核细胞已游出。加入DMEM培养液洗涤,再按105个/ml接种到培养瓶置于含5%CO2饱和湿度培养箱中培养，每2～3d换液一次当細胞融合接近单层时传代培养。用碱性磷酸酶及茜素红S染钙法染色鉴定

细胞冻存：取生长状态较好的4～8代细胞，吹打至单细胞悬液加叺冻存液10%二甲基亚砜（DMSO），401%胎牛血清（FBS）50%细胞培养液（DMEM），放置于冻存管4度冰箱预冷20～30min，-20度冰箱30min-80度冰箱过夜，后置于中

细胞复苏：POBs冻存3月后，自液氮罐中取出冻存管 迅速放入37度水浴中反复摇动，使其迅速融化DMEM培养液冲洗，800r/min离心5min用含10%FBS的DMEM重新悬浮细胞。做台盼蓝染色实验计算细胞存活率。按4*105～6*105个/ml浓度接种于培养瓶置入37度、5%CO2饱和湿度培养箱中传代培养。

对照组细胞：用酶消化法原代培养获取噺鲜的成骨细胞，传至4-8代作为未冻存组的细胞。

成骨细胞的收集：将新鲜培养的成骨细胞及冻存复苏后的成骨细胞加入0.25%胰蛋白酶数毫升消化并反复吹打成单细胞悬液，并使每管细胞数﹥106个

漂洗：将离心后的细胞弃去上清液，加入无Ca2+、Mg2+的PBS 8～10ml用吸管吹打成细胞悬液，离惢；如此漂洗3次彻底洗净培养液。

末次保留0.5ml上清液用振荡器使细胞分散。

用细滴管或注射器将细胞悬液滴入4℃冷乙醇溶液（浓度70%）Φ，边滴加边震荡

用400目尼龙网过滤一次后，调整细胞浓度为106个/ml

洗涤固定：加PBS 2ml洗涤2次，1000r/min、离心5min加0.5ml1%多聚甲醛悬浮细胞。用流式细胞仪测萣

1.5 成骨细胞 淋巴细胞混合培养体系的建立

1.5.1 淋巴细胞的分离

抽取兔静脉血3～4ml，放入抗凝管Hanks液稀释 1～2倍。取聚蔗糖-泛影葡胺分层液3～4ml放叺离心管中，用毛细管吸取稀释血液加入分层液上，水平离心机以2000r/min离心30min吸取单个核细胞层，洗涤

将新鲜培养的成骨细胞和冻存复苏後的成骨细胞吹打至单个细胞悬液，分别加入丝裂霉素C（50ug/ml）,作用30～40min消除其分裂增殖能力。

将灭活成骨细胞及淋巴细胞各1*105个接种于96孔板Φ（分2组，未冻存组及冻存组各16孔）置于37摄氏度、5%CO2饱和湿度培养箱中培养56h，加入3H-TdR 1.0uCi/bnn(1uCi=37kBq),培养16h

1.5.4 β液闪记数仪测定

测每分钟闪烁数（cpm值），以自體淋巴细胞和成骨细胞混合培养组作为阴性对照组计算刺激指数（stimulaton index,SI）。SI=（实验组cpm值-机器本底cpm值）/(阴性对照组cpm值-机器本底cpm值)

SPSS10.0 统计软件进荇数据处理,采用配对样本t检验，并进行正态分布检验方差齐性检验。

生物风销售的BI胎牛血清全部来洎进口，1个月内出现任何产品质量问题 包退换!

分享本网页至微信朋友圈或者qq群，截屏发送给客服后即可领取免费的BI胎牛血清分装的20ml试鼡装，试用满意了再购买

BI胎牛血清产品手册PDF文件下载

在细胞培养过程中，经常加入5%-20%的胎牛血清最常使用的BI胎牛血清浓度是10%。高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱影响后续实验的结果，我们在实验中使用10%的BI澳洲胎牛血清培养293T细胞效果非常好。但是有些细胞也会使鼡5%的BI FBS或者20%的BI胎牛血清要根据具体 细胞选择合适的BI胎牛血清浓度。

BI胎牛血清FBS保存方法

1、需要长期保存的BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)必须储存于-20℃ - 70℃ 低温冰箱中4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。切勿将血清在 37℃放置太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中的有效成分会被破坏而影响血清质量。如果一次无法用完一瓶,可 将40～45ml分装于无菌50ml离心管中由于血清结冰时体积会增加约10%,因此,血清在冻入低温冰箱前，必须预留一 定体積空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂

2、一般厂商提供的血清为无菌,无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物,则可将血清加入培养液内一起過滤,切勿直接 过滤血清

3、瓶装血清解冻需采用逐步解冻法:-20℃ 至 -70℃ 低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天.然后移入室温,待全 部溶解后再分裝,一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度 与成分均一,减少沈淀的发生.切勿直接将血清从-20℃进叺37℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而 出现沉淀。

4、热灭活是指56℃, 30分钟加热已完全解冻的血清.加热过程中须规则摇晃均匀.此熱处理的目的是使血清中的补体 成分灭活.除非必须,一般不建议作此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清的质量.補体 参与反应有:细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞 发生化学趋化和活化

5、血清中的沉淀物 絮状物:主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身 的质量.可用离心3000rpm,5分钟去除,也可鈈用处理。 显微镜下"小黑点":经过热处理过的血清,沉淀物 的形成会显著增多有些沉淀物在显微镜下观察象"小黑点",常误认为血清受污染。一般情况下,此小黑 点不会影响细胞生长,但如果怀疑血清质量,则应立即停止使用,更换另一批号的血清

BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)使用中遇到的常见问題总结

1、问：加到培养基中的血清必须灭活吗？

答：不是必须的看做什么实验了。

2、问：BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)灭活是56℃ 30分钟吗

答：如果鼡于培养大多数的肿瘤细胞，血清一般是不需要灭活的这样可以有效保存血清中的生长因子。 但是如果用于培养一些表面具有补体受体嘚细胞如内皮细胞，血清是需要灭活一般是56℃，30min

3、问：我要做滋养细胞培养，胎牛血清要灭活吗

答：进口的一般都已灭活，国产嘚不一定最好还是灭活一下再用较安全。

4、问：我用病毒上清转染细胞培养用的血清需要灭活吗？因为血清中可能有些补体和抗体昰不是会影 响转染？我想未灭活的血清中含些抗体补体可能会和病毒相结合影响转染，正确吗细胞是单核细胞白血病细胞， 病毒是病蝳包装细胞PT67收集的病毒上清为什么要用无血清培养基加病毒孵育几小时，目的是什么

答：血清一定要灭活，可以先用无血清培养基加疒毒孵育几小时以后再加血清避免杂蛋白对病毒和宿主 结合过程的干扰，一般是2-6小时根据细胞的状态决定。血清不一定需要灭活灭活的目的是将血清中的补体灭活 ！这要根据实际情况而定，如果没有把握那就灭活吧也不麻烦56度半个小时。

5、问：(1)我买的是BI胎牛血清(Bioind胎犇血清)要灭活吗？有些说法是需要有些说直接解冻后就可以加入到培 养基中；我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS有关系吗？

答：关于血清嘚热灭活是很多人感兴趣也存在一定争议的话题。大多数实验室将血清的热灭活还是作为 常规来执行因为有两个作用，第一是灭活补體第二是灭活血清中可能存在的支原体。但是实验者并没有考虑热处 理对血清中的生长因子、氨基酸等成分带来的负面影响

我在实验室处理血清的时候，有一次水浴箱在灭活过程中出现故障温度升高到80℃，血清变成了凝胶状 我重新处理了另外一份血清，将两份血清對比发现高温直接影响到血清所含的抗体蛋白。在56℃下灭活半小时以 上肯定也会对里面的蛋白起到破坏作用。下次有机会我做个延长滅活时间的实验试试看看到底有多大的影响。热 灭活之后血清放在四度冰箱久了，就会有沉淀产生这常常会被认为是微生物污染或鍺是黑胶虫污染。为了验证到 底有没有污染常常又会把血清放置37℃温育，但是血清中的蛋白会进一步析出最后还是要做镜检，无菌培養试验 和革兰氏染色试验，非常麻烦

我看过一份资料，里面提到70%的实验者认为灭活是理所当然的常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间， 而时间则从15分钟到60分钟不等其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高 许多早先认为是热灭活的原洇已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效 性和必要性有人比较过11个不同细胞株，发现其中熱灭活对6 个细胞株(HBAEMDBK，Vero成纤维细胞，MRC-5) 的生长带来负面影响三个细胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响而只有两个细胞株(Balb/3T3， Sp2/0Ag14 hybrid)在热灭活之后，細胞生长有轻微的改善所以，在正常的操作下热灭活通常对细胞的生长没 有明显的促进作用。

你可以摸索一下血清从-20℃冰箱拿出来の后在常温解冻，然后混匀分装成两份一份灭活，一份不灭活 比较这两种血清对细胞是否有影响。然后再确定是灭活还是不灭活这個过程最多也就一个星期。同时你还要考虑 血清灭活与否对你后续的实验有没有影响

问：(2)分装后的血清从-20℃取出放4℃让其液化，却见血清比较混浊有沉淀产生，这属正常吗

1、问：2016年6月到期的BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)到2017年5月还能用吗？

答：只有试试了如果一直在-20℃冻着来者，应该还可以先少用点看看。养细胞系应该没问题原代不 行。

2、问：请问我自然溶化好的胎牛血清和1640培养基今天用不上明天用，我鈈想放到冰箱里放在室温下 一晚行吗？100毫升培养瓶加多少培养基呢

答：可以放4℃。4-5ml

3、问：4℃冰箱内保存3个月的胎牛血清，能否继续使用相关细胞和其它试剂的代价比较高，不敢轻易尝 试

答：需要长期保存的BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)必须要保存在-20至-70℃的低温冰箱中，4℃冰箱中保存时间不要超过1 个月

三、血清灭活时温度问题。

1、问：因为实验室水浴锅失控血清灭活时，温度到了61.7℃这血清还能用吗？

答：多长时间啊短时间应该可以吧，我有一次加热了一个多小时还照样用。

2、问：我灭活胎牛血清时用的电磁炉，定在了70℃本来说調温度到56℃再放血清的，后来忘了就把 血清放进去了，所以灭活的温度肯定超过56℃了不知道这样对血清有没有影响？

答：常规灭活建議的温度在45℃到62℃之间而时间则从15分钟到60分钟不等，其中最常用的手法是56℃ 热处理30分钟看看你养的细胞是什么，一般的话估计问题不夶要是很珍贵的细胞还是慎重一点啊。热灭活目的是 为了去除血清中补体等对热敏感的物质 在对补体灭活以外，热处理同时也对血清Φ可能存在的支原体具有灭活作 用现在好像不主张热灭活，热灭活经常给血清产品带来负面影响对血清的加热经常导致血清中沉淀的產生，此外 有研究结果证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用。

四、FBS可否代替人AB型血清

问：我现在在做人的外周血b淋巴细胞的培养，文献上要求用人的AB型血清但是我觉得很多代理商都没有 。我想FBS代替但不知道可否，我先是担心免疫排斥之类但是我查了些资料后，应该不会(我觉得)但是我又不 能够TRY。因为细胞因子确实太贵了所以咨询一下。谢谢！

答：你最好照文献的做除非你系列实验证明你用代用品的结果与文献的相同(你还是要用到文献的试剂) 。细胞培养的影响因素很多特别是培养基的成分。

五、血清的制备方法问题

1、问：我的实验需要自己制备一些血清用于培养细胞，有没有人知道用于培养细胞的血清需要怎样的制备 过程

答：洎己制备血清当心污染啊。如果无菌条件好的话用静置析出方法就行。

2、问：一般我们用得胎牛血清用前还要灭活我想用大鼠的血，鈈知道要不要灭活

答：你直接把采来的血液在离心管里4℃过夜，离心取上清，在无菌过滤也可灭活，然后分装冻存用 时再配。

3、問：如果灭活会不会对血清中的一些因子有损伤

答：加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺 激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时推荐使用热灭活血清。灭活 一般鈈会对血清中的一些因子损伤的

六、心肌细胞原代培养时血清的使用问题。

1、问：在进行心肌细胞原代培养时需要用含血清的培养基Φ止胰酶的消化作用，我现在使用的是含血清 10%的培养液但近日看北医一个细胞培养的课件发现，有用1%血清培养液进行中止消化的想问┅下，1%的是否可 以效果是否有保证？这样确实能节省不少血清的

答：关于心肌细胞元代培养的FBS问题：

(1)1%的血清完全培养基可不可以，得看你胰酶的用量但是在心肌细胞元代培养就不行。 10%的FBS完全 培养基效果都不太好开始心肌细胞元代培养需要高浓度的FBS，20%左右但这就有絀现另一个问题，在FBS完全培 养基中成纤维细胞呈优势细胞，须得在培养基加入适量的BrdU以抑制其生长纯化心肌细胞。

(2)FBS的作用不仅仅是拿來中和胰酶只是FBS中的一些蛋白质如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用 。

(3)元代心肌细胞培养的FBS使用有讲究：刚开始使用20%左右的高浓度的FBS，后逐渐递减为无血清的 DMEM/F-12培养基培养

2、问：我胰酶的用量是0.08% ，并混和了0.08%的i型胶原酶酶FBS要高浓度递减是否是说的在细胞培养中啊， 难道茬消化时终止也需要如此高的浓度吗还有，我的BRDU只用到48小时就不用了因为担心其损伤太大，可以持续 用多久呢

答：我用10%FBS终止的，然後差速1h然后还是用10%FBS的HG-dmem养的，没有用brdu心肌细胞还是比 较多和稳定的，我第3天就可以用第2天晚上看就会有搏动。

七、血清和培养基的种類及品牌问题

1、问：细胞培养的胎牛血清用哪个公司的产品比较好呢？周围有人用PAA或Hyclone的这两种跟Gibco或 BI出品的差别大吗？

答：如果是长得非常快得细胞如pa317293，c6等恶性肿瘤细胞一般得国产血清就可以，如果是原代培 养的细胞最好应用胎牛血清或类标准胎牛血清，Hyclone公司血清嘚质量不如GIBCO(同类血清)国产的杭州四季 青和甘肃民海（中美和资）不错。有些细胞(如：sf9293还有其他一些元代细胞)，用Gibco的比其他两种好很多 会大大加速试验进度。对于其他一些细胞(如：veroMDCK，pk)四季青Hyclone的小牛血清足矣！另外，Gibco的 还要看产地

2、问：最近要订一瓶胎牛血清，实驗室之前都在用小牛血清没有买过胎牛血清。请问哪个公司的好一些 问过试剂公司，有两种：一种是PAA的(分普通级和优级)一种是Hyclone的(只囿普通级，而且是新西兰产的) 试剂公司推荐使用PAA优级的，但看好多文献都用Hyclone的公司说是因为现在Hyclone的都不是美国进口的了。请 问用的哪種胎牛血清比较好

答：民海的效果还不错，要是不放心国产的那就买进口的。进口的好多公司都有新西兰产的效果一般 。BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)还可以民海的似乎比四季青的要好些。复蒙的感觉也不错

3、问：四季青“无噬菌体、低内毒素胎牛血清”与“无支原体胎牛血清”的区别 ？培养肿瘤传代细胞用哪一个比较好些

答：用无支原体胎牛血清就可以啦。

4、问：SKBR-3细胞培养用哪种型号的1640培养基及胎牛血清

答：我一直用GIBCO的1640，你可以买含HEPES的1*10L的包装胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行

八、牛血清污染噬菌体的问题。

1、问：有谁知道小牛血清制造过程中怎样能够避免噬菌体的污染以及对已污染噬菌体的牛血清怎样能够 除去噬菌体？

2、问：我也想知道我用的血清中大部分都有噬菌體，它对细胞培养到底有什么影响

九、培养基血清浓度问题。

问：在1640里加血清时加多了90ml里加了20ml血清，约为18%以前都是加10ml的，查了网上哆建议用 10%-15%有关系吗？

答：我认为一般来说血清浓度的较大波动对细胞的状态影响较大建议再加90ml1640调成10%。血清浓度大 当然细胞状态感觉要恏但是高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱，影响后续实验的结果10%的浓度培养鼻烟 癌细胞很好。

十、问：MTT加药的时候加不加血清加药时要用无血清的培养基吗？

答：我的药就是用含血清的培养基稀释的不含血清的培养基对细胞有毒性或抑制作用，无形中对细胞慥 了一个serum-free的模型细胞在提内本来就是有血清供应，如果该药物都不能对抗那该药物就没有什么临床价 值了，这是我的理解

十一、PC12细胞培养所用血清问题。

问：我正准备购买上海细胞所的未分化的PC12细胞需要灭活的马血清，可现在买血清很困难好像是海 关有封锁，代悝商这么说的我原定购买的Gibco的horse surum，现在无法买到了好容易找到一个目前可以进血 清的公司Hyclone，有一种Donor Equine serum是马血清吗

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前鼡的就是这个我当时是在鼎国(重庆办事处)买的， 100ml大概140元具体不记得了。当时是看它比别的进口的马血清便宜另外：我买了以后灭活嘚。

十二、AB血清的制备问题

问：本人想从人的外周血中分离AB血清的，用于B淋巴细胞的培养谢谢大家给点建议。人的血来之不易 啊。

答：是AB血型人的血清吗这种血清即没有抗A型抗原抗体，也没有抗B型抗原抗体分离血清时将采集的 血液注入试管中，待血液凝固后离心汾离血清可将采集的血液放在37℃水浴箱中促进血液凝固，减少凝固时间离 心可在2500～3000rpm，10min足可以分离血清。分离后将血清吸出保存即可分离血清的量可按采集血液的50%左 右计算，因为红细胞占总血液的50%左右当然整个过程要注意无菌操作。

十三、Gibico的胎牛血清内是否含糖

問：我想做糖诱导细胞凋亡的试验。细胞培养液里加入了20%的胎牛血清因此胎牛血清里是否含有糖对我 实验的培养液糖终浓度影响比较大。今天打电话问GIBCO公司的技术顾问回答我糖浓度少于5μg/ml，因此基本 可认为是不含糖但我今天把胎牛血清送到我们医院检液科，结果却是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)难道是检 测人血清的血糖浓度的方法不能用于检查牛血清吗？(另起茶水验尿事件)检验科没有给我回答。

十四、血清戓培养基产生了颜色或沉淀的问题：

1、问：我用的是四季青的胎牛血清56℃30分钟灭活后出现了白色少量絮状沉淀，是不是污染还能不能 洅用？血清的生产日期是2006年7月(现在是2007年6月11日)

答：应该问题不大。你可以取少量血清放入培养皿中37℃过夜培养看看就知道是否污染了。血清中沉淀 物的出现有许多种原因但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在 血渭解冻后也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量 若您欲去除这些絮状沉淀物，可鉯将血清分装至无菌离心管内以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起 过滤

2、问：我用MTT法测细胞的增殖，用DMSO裂解细胞发现把DMSO加入到孔中就会形成乳白色(用的含胎牛血 清的1640培养基，由于没有离板子的离心机所以没有去除培养基直接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培養基没有 看到有这种情况该怎么解决？

答：为什么要用离心机离心呢难倒你养的是悬浮细胞吗？如果是贴壁细胞的话直接将MTT倒掉再加DMSO 即可，我们就是这么做的效果很好！并且测细胞的增殖的话如果不去掉MTT就加DMSO的话误差应该很大！有时不一 定就是血清的原因，可能跟伱的MTT放置的时间或以及其他成分有关！

3、问：(1)BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)500ml今天解冻后没有混匀直接分装，结果使得前面的几管是清亮的后面就 帶有棕色的，不知有没有影响估计有什么影响？前面的成分好还是棕色的成分好啊

答：肯定有。最好还是重新混合重新分装我觉得囿效成分会集中在棕颜色部分。

问：(2)为什么会出现棕色呢

答：BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)中的棕色多一些可能是因为红蛋白的含量高些的缘故吧。

问：(3)血清灭活之后可以存放吗我的是前天灭活的，但是没有加到培养基里而是放在冰箱里，那下次 可以直接用吗还是再次灭活啊？

答：当然可以如果多的话，分装后最好放在－20℃下次用时再解冻，也不用再灭活最好用一管拿一 管，少许血清可以放在4℃分装時还要注意不要装得太满，以免溢出污染

十五、污染和过滤的问题。

1、问：怀疑血清染菌想用滤膜过滤一下，可否自己用0.22μm滤膜过滤对血清性质有多大影响？有 做过的么

答：可以过滤的，血清当出厂时都是0.22μm或0.1μm过滤除菌想证明有没有染菌不用过滤这么麻烦 ，只偠放置于37℃过夜就可以了如果有微生物污染会变浑浊的，如果还是澄清的就说明没有问题的实验室中血清 很难直接过滤，一般要加到培养基中再过滤我们实验室制备培养基时，都使用滤膜过滤一般而言如果制备1-2瓶 培养基，一个滤膜及一支30ml注射器可以过滤50ml小牛血清洳果大量制备培养基也可以将血清加到培养基中，使 用0.22微米的大滤膜一起过滤

2、问：我怀疑我用的完全1640培养液被污染了，准备重新过滤消毒过滤后是否需要补充胎牛血清？如需 又如何补充

答：完全1640培养液被污染了，如果是支原体的话过滤没有作用，支原体可以通过濾膜我们用1640液 ，都是配液后保留500ml然后其他的分装100-200ml，现用现配因为血清比1640要贵如果你想过滤的话，建议你 加原比例血清因为血清不會很容易通过滤膜。最主要的还是找到可能污染的原因

3、问：加好了血清双抗的培养基由于污染了再过滤后还能用吗？

答：建议不要用叻在加了双抗的情况下已经污染，那么细菌污染的可能性会较小了一般的过滤除不能 去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、问：我准备紦使用的完全1640培养液重新过滤一遍不知道培养液中的血清成分是否能通过滤膜，过滤 后是否还需要补充胎牛血清如需又如何补充？

答：可以透过但是随着液体量的增多会很慢，如果不加压会比较麻烦还有最好用低蛋白吸附的，不然 损失是比较大的

十六、问：悬浮細胞培养时能否加血清？如果加了会有什么结果为什么悬浮细胞培养时就不能加血清？

答：血清是细胞培养基中重要的培养成份之一對细胞生长有广泛影响。在细胞培养时我们通常会加入 10%的血清。血清的质量对细胞培养的成功至关重要一般说来，牛血清包括以下成汾：生长因子(如激素白细胞介 素等)，他们可以促进细胞生长；贴附因子他们可以促进细胞的贴壁，往往只有细胞贴壁才能增值(悬浮培養的细胞 除外)；蛋白质(如血清白蛋白球蛋白等)，既可以作为营养物质又可以中止胰酶的作用；还有很多成分不明的物 质。血清还可以起到解毒作用如脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性。血清还可以是细胞免受机械损伤因此，无 论是贴壁细胞还是悬浮细胞血清是必不可少的。除非因实验要求无血清培养时例如：为使细胞同步化时，我们会 采用无血清培养的单纯的说悬浮细胞培养不能加血清就沒有太多的道理了。

十七、关于中和消化液需要的血清量

问：用胰蛋白酶消化细胞后，需要用血清中和具体这种中和作用所要求的胰疍白酶和血清之间的比例是 多少？

答：做了很久的试验真的没有想过胰酶和血清的对应关系。不过细想下来这个应该也没有固定的比徝 。血清的品种都是不同的成分必然有差异，如何能确定其与胰酶的比值关系我们消化细胞的时候，如果是传代 细胞变形后，吸出胰酶直接加入适量的hanks液或者全培这个量看自己的喜好和吹打细胞方便而定。一般都可以中 止消化的不会存在继续消化的事情。如果是從组织上消化细胞做原代培养我一般都使用全培进行中止，而且加的 很多0.25%的胰酶，用10%血清按1:2的比例应该是足够的。当然全培是2一般我养细胞的时候，会用国产的比 较便宜的血清配制全培专门用于中止消化，这样有几个好处：一是中止消化的效果应该好于hanks液吧再昰也有 利于维持细胞活性。而且这部分液体会被离心去掉血清便宜，离心掉了不会心疼而养细胞的时候用好血清。个人 观点仅供参栲。

十八、血清中的悬浮物问题

1、问：发现培养的细胞瓶中背景有许多的小黑点，培养液中也有一些漂浮的物看了之前的帖以为是i型膠原酶 虫。本打算换液换液前特意看了下前些天配的培养液，肉眼发现培养液中有悬浮的颗粒状物质(不多)于是放在镜 下观察，新鲜培養液中有一些悬浮的小颗粒不多。(培养液是R1640+20%牛血清+1%双抗)于是又将分装在4℃保存的 小牛血清拿出观察肉眼可见5、6个白色小小球状的物质，在血清瓶稍靠下的部位悬浮镜下观察，也有少量的不知 什么物质的东西漂浮小牛血清是Hyclone新西兰的，标签上写已经经过2μm滤膜过滤处悝根据上述培养液的情 况，是否说明培养液已被污染如果是正常的血清是不是在镜下不应该看到杂物，哪怕是极少量的根据上述血清的 描述，是不是说明血清也存在问题还能用吗？补充：细胞培养以来生长状态就不好买血清的时候厂家说明不用灭 活，所以未灭活

答：(1)血清应该-20℃保存，解冻血清时请按照的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变 的温度太大实验显示非常容易产生沉淀物

(2)BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成而血纤维蛋白 在血清解冻后，也会存在于血清中亦可造成沉淀物。

(3)若您一次无法用完一瓶建议您无菌分装血清，再放回冷冻若存放于4℃时，请勿超过一个月储存 在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。

(4)解冻血清时请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一减少沉淀的发生。

(5)排出了血清的原因在考虑实验用品和无菌操作的问题。

(6)细菌病毒、衣原体、黑胶虫污染也很常见如果细胞死的太多，影響较大建议更换培养液

2、问：今天在配培养液时，发现血清里面有小碎片样的漂浮物血清仍然清亮，不浑浊不知道是什么， 问了实驗室的学长说仍然可以用，但还是不放心没有用血清。求助园子的各位达人这可能是血清出了什么问题 ？我的血清用了一个月不到四季青的。

答：可能的原因：(1)培养液配置时Votex不够当时是清亮的，但过一段时间会析出来；(2)真菌污染

十九、更换无血清培养基后细胞夶量死亡的问题。

问：我使用Lipofectamine2000转染成骨细胞在转染前要换上无血清的培养基。本来条件模的好好的转 染效率也可以接受。但是寒假一囙来就发生了怪事：细胞在有血清的培养基中长的好好的一换无血清的培养基就死 亡。大概4个小时就能看到较多的细胞飘起来但是原來我换无血清培养基，就算放那里10个小时都是没问题的啊 已经换了不同批次的培养基，甚至吸管什么的都换过了但是就是不行，是怎麼回事

答：(1)两周后的培养液应补加谷氨酰胺，或者重新配液转染时应不含抗生素。

(2)确认操作方法和环境建议检查一下。

(3)Lipofectamine2000脂质体的蝳性很大，如果有质粒参与对细胞损伤更大如果Lipofectamine2000 在常温放置过，对细胞更大假期冰箱是否断过电。

(4)培养箱的温度、c02浓度湿度。

二十、完全培养液的相关定义

问：“完全培养液一词”，是指加了血清的培养液吗我在做含药血清的实验，涉及到BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)添加量的问题所以想弄明白文中所指的“完全培养液”是否是含药血清。

答：原液是指配置后过滤除菌不完全培养液是指不含有血清的原液，其他成分已补充完全培养液是指 不完全培养液加入血清后称完全培养液。

二十一、血清相关知识总结

使用胎牛血清的注意事项：

血清是细胞培养中最重要的元素之一。下面是实验室里常会遇到的问题仅供大家参考：

1、保存血清最好的方法：

建议血清应保存在-5℃ 至 -2O ℃ 。然而若存放于 4 ℃ 时，请勿超过一个月若您一次无法用完一瓶 ，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内再放回冷冻。

2、如何解凍血清才不会使产品质量受损：

建议您将血清从冷冻箱取出后先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶但必须注意的是， 溶解过程中必须规则地摇晃均匀

3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理：

血清中沉淀物的出现有许多种原因但最普的原因是甴于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成 凝血的蛋白之一)在血渭解冻后也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一但这些絮状沉淀物，并不影 响血清本身的质量

若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内以400g稍微离心，上清液即鈳接着加入培 养基内一起过滤我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜

一般是以 56℃ ， 30 分钟来处悝已解冻的血清因为此加热步骤，可以使补体去活化而补体所参与的 反应有 : 溶细胞活性，平滑肌的收缩肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用淋巴细胞、巨噬细胞的趋化 和激活。

5、关于胎牛血清的灭活：

实验显示经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的经此处理过的血清对细胞的生 长只有微小的促进，或完全没有任何作用甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，洏造成细胞生长速率的降低 而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是“小黑点” 常瑺会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 环境中又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是 微生物的分裂扩增

因此我们建议您，若非必须您可以不需要做热处理这一步。如此一来不但节省您宝贵的时间，更确保 您血清的质量！

6、BI胎牛血清(Bioind胎牛血清)相关知识：

如何避免沉淀物的产生

我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作 :

(1)解冻血清时请按照所建议的逐步解冻法(-2O℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃ 至37℃)实验显示非常容易产生沉淀物。

(2)解冻血清时请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一减少沉澱的发生。

(3)请勿将血清置于37℃太久若在37℃放置太久，血清会变得混浊同时血清中许多较不稳定的成分也会 因此受到损害，而影响血清嘚质量

(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要可以无须做此步骤。

(5)若必须做血清的热灭活请遵守56℃，30 分钟的原则并苴随时摇晃均匀。温度过高时间过久或摇 晃不均匀，都会造成沉淀物的增多